5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸-组蛋白H3双标记方案用于 果蝇 神经干细胞的细胞周期进展分析
Summary
使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一个多步骤程序，可能需要广泛的优化。在这里，我们提出了一个详细的方案，描述了该过程的所有步骤，包括图像分析和定量，以区分不同细胞周期阶段的细胞。
Abstract
体内 细胞周期进展分析通常在调节有丝分裂和DNA复制的基因研究中进行。5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）已被用于研究复制性/S相进展，而针对磷酸组蛋白H3的抗体已被用于标记有丝分裂细胞核和细胞。两种标签的组合将能够对G0 / G1（间隙期），S（复制性）和M（有丝分裂）相进行分类，并作为评估有丝分裂基因敲低或零突变体对细胞周期进展的影响的重要工具。然而，用于标记EdU标记细胞的试剂与几种二抗荧光标记不相容。这使得免疫染色复杂化，其中原代和标记的二抗用于标记pH3阳性有丝分裂细胞。本文描述了 果蝇 幼虫神经干细胞中EdU和pH3双重标记的分步方案，该系统被广泛用于研究有丝分裂因子。此外，还提供了用于图像分析和定量的方案，以分配3个不同类别的标记细胞，G0 / G1，S，S，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M相。
Introduction
细胞分裂周期包括G1期（第一间隙期），复制期/S期，G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期）。通过这些阶段，细胞经历细胞转录，翻译和细胞骨架机制1，2的重组发生巨大变化。作为对发育和环境线索的反应，细胞可能暂时停止分裂并变得静止（G0）或分化并永久停止分裂3。其他情况，如DNA损伤，可能导致过早分化或凋亡3，4。对这些线索的反应由细胞周期检查点介导，其充当监视系统，以确保细胞进入分裂周期5的下一阶段之前基本细胞过程的完整性。因此，对调节DNA复制，检查点和有丝分裂机制的基因的研究需要分析突变细胞中或siRNA敲低这些基因时可能发生的细胞周期进展缺陷。此外，这种分析可用于测试整体细胞健康以及细胞对药物治疗的反应。
5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）是一种胸腺嘧啶类似物，在复制过程中掺入DNA6。该方法被广泛用于鉴定S期细胞。然而，然后将细胞进行苛刻的DNA变性程序，以允许通过使用抗BrdU抗体6来检测BrdU。这种苛刻的处理可能会损害细胞表位，并阻止通过免疫染色进一步表征样品。EdU掺入和随后通过铜催化的”咔哒反应”与小的，可渗透的，荧光标记的叠氮化物染料进行检测，消除了对苛刻变性程序的需要7。因此，这种方法成为BrdU合并的更实用的替代方案。
此外，pH3已被描述为有丝分裂/M相细胞8的可靠标志物。组蛋白H3是一种DNA相关的核心组蛋白，在G2期晚期至M期早期左右磷酸化，并在8期末期脱磷酸化。几种商业抗体可用于使用标准免疫染色方案检测pH3。因此，EdU和pH3的双重染色将能够检测S相和M相的细胞。此外，G1和早期G2期的细胞不会对任何一种标志物进行阳性染色。
果蝇 神经干细胞或神经母细胞（NBs）提供了一种表征良好的干细胞模型，其中细胞不对称地分裂以产生一个相同的自我更新NB和一个神经节母细胞（GMC），其注定要分化9。此外，几种遗传工具和NB特异性抗体使该系统适用于遗传操作和活细胞成像。因此，一些研究利用NB来研究调节不对称分裂和细胞命运决定的基因9。在幼虫脑的中央脑（CB）和视叶（OL）中存在不同的NB种群9;CB NB用于本研究。这些三龄幼虫CB NBs是大细胞，也适用于研究调节有丝分裂纺锤体组装的因素。分析细胞周期进展缺陷的方案将是此类研究的重要工具。
先前发布的实验方案采用商业试剂盒，如Click-iT EdU Alexa Fluor Cell增殖试剂盒，其提供几种反应组分和用各种Alexa Fluor染料标记的叠氮化物染料，用于EdU掺入和检测10。然而，与此类试剂盒一起提供的试剂与通常与二抗一起使用的一些荧光标签不相容。该EdU检测试剂盒（Click-iT EdU Alexa Fluor细胞增殖试剂盒，随Alexa Fluor 647偶联叠氮化物染料一起提供）在 果蝇 三龄幼虫NB中进行了测试，并尝试使用针对pH3和Miranda（一种NB标记物）的抗体进行共染色。此外，Alexa Fluor 568或Cy3标记的二抗用于检测NB11质膜上的Miranda标记。然而，在EdU检测后进行免疫染色时，这些二抗未观察到预期的信号强度和染色模式（未发表的结果）。
对于EdU掺入，Daul及其同事描述的方案需要用与EdU和溴酚蓝（BPB）混合的Kankel-White培养基喂养幼虫10。幼虫以EdU和BPB刺激的食物为食，在幼虫肠道中摄入时可以通过其蓝色看到。虽然这种方法被用于将EdU掺入 Mms19 功能丧失（Mms19P）三龄幼虫中，但 Mms19P 幼虫显然没有进食，因为在幼虫肠道中几乎没有检测到任何蓝色（未发表的结果）。 Mms19P 幼虫表现出剧烈的发育畸形，最终在第三龄期停滞。这可能会以某种方式影响三龄幼虫的摄食行为，并使EdU喂养方案不适合这种情况。
在研究了现有文献并广泛研究了基本步骤的标准化之后，提出了一种替代方法，用于果蝇NB中的EdU / pH3双标记，这不需要将EdU喂养到幼虫。之前的一项研究采用双EdU / pH3染色来分析NB中的细胞周期，但没有提供详细的方案4。这为尝试实现此方法的实验室带来了不必要的障碍。此外，评估各种试剂与EdU试剂盒的相容性并进行进一步优化可能是一个耗时的过程。本文提出了一个分步方案，涵盖了在解剖的幼虫脑中掺入EdU和用抗pH3抗体进行免疫染色，然后进行共聚焦显微镜和图像分析，将NB分配到四个不同的类别：G0 / G1期，S期，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M期。概述了需要优化的步骤，并提供了有关大型数据集的图像分析的提示。此外，还分析了野生型NB中的EdU / pH3读数，并将其与Mms19P NBs进行了比较，Mms19 P NB最近报道显示细胞周期延迟11。
Protocol
Representative Results
Discussion
与先前使用的BrdU方法相比，EdU掺入及其随后与细胞渗透性叠氮化物的”咔哒”反应提供了该技术的实际优势7。然而，该反应是由Cu（I）离子催化的，并且几种染料在该铜催化剂的存在下可能不稳定，正如Click-it EdU试剂盒制造商明确建议的那样。在执行EdU检测步骤后进行免疫染色实验时，使用红色通道染料Alexa Fluor 568和Cy3未观察到预期的信号强度。然而，当免疫染色反应在EdU检测步…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了瑞士国家科学基金会（项目赠款31003A_173188;www.snf.ch）和伯尔尼大学（www.unibe.ch）对理学学士的资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
Referências
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