5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila
Summary
تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2′-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.
Abstract
في الجسم الحي تحليل تطور دورة الخلية يتم إجراؤها بشكل روتيني في الدراسات على الجينات التي تنظم الانقسام وتكرار الحمض النووي. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) وقد استخدمت للتحقيق في تطور النسخ المتماثلة / S-المرحلة, في حين استخدمت الأجسام المضادة ضد فوسفو-هيستون H3 للاحتفال نواة ميتوتيك والخلايا. ومن شأن الجمع بين كلا التسميتين أن يمكن من تصنيف مراحل G0/G1 (مرحلة الفجوة) و S (النسخ المتماثل) و M (mitotic) وأن يكون بمثابة أداة هامة لتقييم آثار الضربات المسقطة للجينات الميتوتيكية أو المسوخ الخالية على تطور دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن الكواشف المستخدمة لوضع علامة على الخلايا الموسومة ب EdU لا تتوافق مع العديد من العلامات الثانوية الفلورية للأجسام المضادة. وهذا يعقد التثقين المناعي، حيث تستخدم الأجسام المضادة الثانوية الأولية والموسومة لوضع علامة على الخلايا الميتوتيكية الإيجابية لhH3. تصف هذه الورقة بروتوكولا تدريجيا لوضع العلامات المزدوجة ل EdU و pH3 في الخلايا الجذعية العصبية يرقات Drosophila ، وهو نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة العوامل الميتوتيكية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكول لتحليل الصورة وتحديد كميتها لتخصيص الخلايا المسماة في 3 فئات متميزة، G0/G1، S، S>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومراحل M.
Introduction
وتتألف دورة تقسيم الخلية من مرحلة G1 (مرحلة الفجوة الأولى)، ومرحلة متماثلة/S، ومرحلة G2 (مرحلة الفجوة الثانية)، ومرحلة M (ميتوتيك). يمر عبر هذه المراحل, الخلية يخضع لتغيرات جذرية في النسخ الخلوي, ترجمة, وإعادة تنظيم الآلات الهيكل الخلوي1,2. استجابة للإشارات التنموية والبيئية، قد تتوقف الخلايا مؤقتا عن الانقسام وتصبح هادئة (G0) أو تفرق وتتوقف نهائيا عن تقسيم3. سيناريوهات أخرى، مثل تلف الحمض النووي، قد يسبب التمايز المبكر أو موت الخلايا المبرمج3،4. تتم الاستجابة لمثل هذه الإشارات عن طريق نقاط التفتيش دورة الخلية، والتي تعمل كنظام مراقبة لضمان سلامة العمليات الخلوية الأساسية قبل أن تلتزم الخلية إلى المرحلة التالية من دورة التقسيم5. لذلك، تحتاج الدراسات على الجينات التي تنظم تكرار الحمض النووي ونقاط التفتيش والآلات الميتوتيكية إلى تحليل عيوب تطور دورة الخلية المحتملة التي قد تحدث في الخلايا المتحولة أو عند ضربة قاضية من هذه الجينات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التحليلات لاختبار الصحة العامة للخلايا وكذلك الاستجابات الخلوية للعلاج من المخدرات.
5-برومو-2′-deoxyuridine (BrdU) هو التناظرية التي يتم دمجها في الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل6. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لتحديد الخلايا في مرحلة S. ومع ذلك ، تخضع الخلايا بعد ذلك لإجراءات تشبع الحمض النووي القاسية للسماح بالكشف عن BrdU من خلال استخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU6. قد يؤدي هذا العلاج القاسي إلى تلف الأسطح الخلوية ومنع المزيد من توصيف العينة من خلال التخبز المناعي. دمج EdU والكشف اللاحق من قبل النحاس الحفاز، ‘انقر رد فعل’ مع صغيرة، نفاذية الخلية، الأصباغ azide الموسومة فلوريا يلغي الحاجة إلى إجراءات التشبع قاسية7. ولذلك، برزت هذه الطريقة كبديل عملي أكثر لإدراج BrdU.
وعلاوة على ذلك، وقد وصفت pH3 كعلامة موثوق بها لخلايا المرحلة ميتوتيك / M8. الهستون H3 هو بروتين الهستون الأساسية المرتبطة بالحمض النووي الذي يصبح الفوسفوريلات في جميع أنحاء المرحلة المتأخرة G2 إلى مرحلة M في وقت مبكر ويتم إزالة الفوسفوريلات قرب نهاية anaphase8. يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة التجارية للكشف عن pH3 باستخدام بروتوكولات الاحتواء المناعي القياسية. ولذلك فإن التلطيخ المزدوج ل EdU وpH3 سيمكن من اكتشاف الخلايا في مرحلة S وكذلك في مرحلة M. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا في مرحلة G1 وG2 في وقت مبكر لا وصمة عار إيجابية لأي من علامات.
Drosophila الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا العصبية (NBs) تقدم نموذج الخلايا الجذعية تتميز جيدا حيث تنقسم الخلايا بشكل غير متماثل لإنتاج واحد متطابقة الذاتي تجديد NB وخلية الأم العقدة (GMC), الذي يقدر للتمايز9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأدوات الوراثية والأجسام المضادة الخاصة NB جعل هذا النظام مناسبة للتلاعب الجيني والتصوير بالخلايا الحية. ونتيجة لذلك، استخدمت العديد من الدراسات NBs لدراسة الجينات التي تنظم الانقسامات غير المتماثلة وتحديد مصير الخلية9. توجد مجموعات متميزة من NBs في الدماغ المركزي (CB) والفص البصري (OL) في الدماغ اليرقات9؛ واستخدمت هيئة بناء الثقة في الدراسة الحالية. هذه اليرقات الإنستار الثالث CB NBs هي خلايا كبيرة مناسبة أيضا لدراسة العوامل التي تنظم تجميع المغزل الميتوتيكي. بروتوكول لتحليل عيوب تطور دورة الخلية سيكون أداة حيوية في مثل هذه الدراسات.
البروتوكولات التي نشرت في وقت سابق تستخدم مجموعات تجارية، مثل Click-iT EdU اليكسا فلور خلية انتشار كيت، والتي توفر العديد من مكونات التفاعل والأصباغ azide الموسومة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ اليكسا فلور لدمج EdU والكشف10. ومع ذلك ، فإن الكواشف المزودة بهذه المجموعات غير متوافقة مع بعض العلامات الفلورية التي تستخدم في كثير من الأحيان مع الأجسام المضادة الثانوية. تم اختبار مجموعة الكشف عن EdU هذه (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit المزودة بصبغة أزيد فلور 647-المقترنة) في Drosophila الثالثة NBs اليرقات instar ، وجرت محاولة التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة ضد pH3 وميراندا ، وهي علامة ل NBs. وعلاوة على ذلك، استخدمت اليكسا فلور 568- أو Cy3 الموسومة الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن وضع العلامات ميراندا على غشاء البلازما من NBs11. ومع ذلك، لم يلاحظ شدة الإشارة المتوقعة ونمط التلطيخ (النتائج غير المنشورة) مع هذه الأجسام المضادة الثانوية عندما تم إجراء التصبغ المناعي بعد الكشف عن EdU.
بالنسبة لدمج EdU ، يتطلب البروتوكول الذي وصفه Daul وزملاؤه تغذية اليرقات مع متوسط Kankel-White مختلط مع EdU وbroophenol blue (BPB)10. تتغذى اليرقات على EdU و BPB – ارتفعت المواد الغذائية ، والتي يمكن رؤيتها بلونها الأزرق عند الابتلاع في القناة الهضمية اليرقات. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت تستخدم لدمج EdU في Mms19 فقدان الوظيفة(Mms19P) يرقات النجوم الثالثة ، إلا أن يرقات Mms19P لم تتغذى على ما يبدو حيث لم يتم اكتشاف أي لون أزرق في الأمعاء اليرقات (نتائج غير منشورة). تظهر يرقات Mms19P تشوهات تنموية شديدة وتعتقل في نهاية المطاف في المرحلة الثالثة من النجوم. قد يؤثر هذا بطريقة أو بأخرى على سلوك التغذية ليرقات النجوم الثالثة ويجعل بروتوكول تغذية EdU غير مناسب لمثل هذه الحالات.
بعد دراسة الأدبيات المتاحة والعمل على نطاق واسع على توحيد الخطوات الأساسية ، تم اقتراح نهج بديل لوضع العلامات المزدوجة EdU/pH3 في Drosophila NBs ، والتي لا تتطلب تغذية EdU إلى اليرقات. استخدمت دراسة سابقة تلطيخ ثنائي EdU/pH3 لتحليل دورة الخلية في NBs ، ولكنها لم تقدم بروتوكولا مفصلا4. وهذا يمثل عقبة لا داعي لها للمختبرات التي تحاول تنفيذ هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تقييم توافق الكواشف المختلفة مع مجموعة أدوات EdU وإجراء المزيد من التحسين عملية تستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يغطي دمج EdU في أدمغة اليرقات المتشرذم والتبويب المناعي بالأجسام المضادة لpH3 ، يليه المجهر الكونفوج وتحليل الصورة لتخصيص NBs لأربع فئات متميزة: مرحلة G0/G1 ، مرحلة S ، S>G2 / M (التقدم من S إلى G2 / M) ، ومرحلة M. يتم تحديد الخطوات التي تحتاج إلى التحسين والنصائح المقدمة لتحليل الصور لمجموعات البيانات الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل قراءات EdU/pH3 في NBs البرية من النوع ومقارنة مع MMS19P NBs، والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لإظهار تأخير دورة الخلية11.
Protocol
Representative Results
Discussion
إدراج EdU ورد الفعل اللاحق “انقر فوق” مع azide نفاذية الخلية يقدم مزايا عملية لهذه التقنية على طريقة BrdU المستخدمة في وقت سابق7. ومع ذلك ، يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل أيونات Cu(I) ، وقد تكون العديد من الأصباغ غير مستقرة في وجود هذا المحفز النحاسي ، كما ينصح بوضوح مصنع مجموعة Click-it EdU. عن?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة المشروع 31003A_173188؛ www.snf.ch) وجامعة برن (www.unibe.ch) إلى بكالوريوس العلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات، والتحليل، وقرار نشر المخطوطة، أو إعدادها.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
Referências
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
