5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells
Summary
Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.
Abstract
Die In-vivo-Analyse der Zellzyklusprogression wird routinemäßig in Studien an Genen durchgeführt, die mitose- und DNA-Replikation regulieren. 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin (EdU) wurde verwendet, um die replikative / S-Phasenprogression zu untersuchen, während Antikörper gegen Phospho-Histon H3 verwendet wurden, um mitotische Kerne und Zellen zu markieren. Eine Kombination beider Markierungen würde die Klassifizierung der Phasen G0/G1 (Gap Phase), S (replikativ) und M (mitotisch) ermöglichen und als wichtiges Instrument zur Bewertung der Auswirkungen von mitotischen Gen-Knockdowns oder Nullmutanten auf den Zellzyklusverlauf dienen. Die Reagenzien, die zur Markierung von EdU-markierten Zellen verwendet werden, sind jedoch mit mehreren sekundären Antikörper-Fluoreszenz-Tags nicht kompatibel. Dies erschwert die Immunfärbung, bei der primäre und markierte sekundäre Antikörper verwendet werden, um pH3-positive mitotische Zellen zu markieren. Dieses Papier beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die duale Markierung von EdU und pH3 in Drosophila-Larven-Neuralstammzellen, einem System, das umfassend zur Untersuchung mitotischer Faktoren verwendet wird. Zusätzlich wird ein Protokoll für die Bildanalyse und Quantifizierung bereitgestellt, um markierte Zellen in 3 verschiedene Kategorien zuzuordnen, G0 / G1, S, S >G2 / M (Progression von S nach G2 / M) und M-Phasen.
Introduction
Der Zellteilungszyklus umfasst eine G1-Phase (erste Gap-Phase), eine replikative/S-Phase, eine G2-Phase (zweite Gap-Phase) und eine M-Phase (mitotic). Durch diese Phasen durchläuft die Zelle dramatische Veränderungen in der zellulären Transkription, Translation und Reorganisation der Zytoskelettmaschinerie1,2. Als Reaktion auf Entwicklungs- und Umwelteinflüsse können Zellen vorübergehend aufhören, sich zu teilen und ruhen (G0) oder sich differenzieren und dauerhaft aufhören, sich zu teilen3. Andere Szenarien, wie DNA-Schäden, können eine vorzeitige Differenzierung oder Apoptose verursachen3,4. Die Reaktion auf solche Hinweise wird durch Zellzyklus-Checkpoints vermittelt, die als Überwachungssystem fungieren, um die Integrität wesentlicher zellulärer Prozesse sicherzustellen, bevor sich die Zelle zur nächsten Phase des Teilungszyklusverpflichtet 5. Daher müssen Studien zu Genen, die die DNA-Replikation, Checkpoints und mitotische Maschinerie regulieren, mögliche Zellzyklus-Progressionsfehler analysieren, die in mutierten Zellen oder beim siRNA-Knockdown dieser Gene auftreten können. Darüber hinaus können solche Analysen verwendet werden, um die allgemeine Zellgesundheit sowie zelluläre Reaktionen auf eine medikamentöse Behandlung zu testen.
5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidin-Analogon, das während der Replikation in die DNA eingebaut wird6. Diese Methode wurde ausgiebig verwendet, um Zellen in der S-Phase zu identifizieren. Die Zellen werden dann jedoch harten DNA-Denaturierungsverfahren unterzogen, um den Nachweis von BrdU durch die Verwendung von Anti-BrdU-Antikörpern zu ermöglichen6. Diese harte Behandlung kann zelluläre Epitope schädigen und eine weitere Charakterisierung der Probe durch Immunfärbung verhindern. Der Einbau von EdU und der anschließende Nachweis durch eine kupferkatalysierte “Klickreaktion” mit kleinen, zelldurchlässigen, fluoreszierend markierten Azidfarbstoffen macht harte Denaturierungsverfahrenüberflüssig 7. Diese Methode erwies sich daher als praktischere Alternative zur BrdU-Gründung.
Darüber hinaus wurde pH3 als zuverlässiger Marker für Mitotik/M-Phasenzellen beschrieben8. Histon H3 ist ein DNA-assoziiertes Kern-Histonprotein, das in der späten G2-Phase bis zur frühen M-Phase phosphoryliert und gegen Ende der Anaphase8dephosphoryliert wird. Mehrere kommerzielle Antikörper können verwendet werden, um pH3 mit Standard-Immunfärbungsprotokollen nachzuweisen. Eine Doppelfärbung von EdU und pH3 würde daher den Nachweis von Zellen sowohl in der S-Phase als auch in der M-Phase ermöglichen. Darüber hinaus würden Zellen in der G1- und frühen G2-Phase für keinen der Marker positiv färben.
Drosophila neurale Stammzellen oder Neuroblasten (NBs) bieten ein gut charakterisiertes Stammzellmodell, bei dem sich Zellen asymmetrisch teilen, um eine identische selbsterneuernde NB und eine Ganglien-Mutterzelle (GMC) zu produzieren, die zur Differenzierung bestimmt ist9. Darüber hinaus machen mehrere genetische Werkzeuge und NB-spezifische Antikörper dieses System für die genetische Manipulation und Lebendzellbildgebung geeignet. Folglich haben mehrere Studien NBs verwendet, um Gene zu untersuchen, die asymmetrische Divisionen und die Bestimmung des Zellschicksals regulieren9. Verschiedene Populationen von NBs existieren im zentralen Gehirn (CB) und im Optikuslappen (OL) des Larvengehirns9; Für die aktuelle Studie wurden CB-NBs verwendet. Diese CB-NBs der Larven im dritten Stadium sind große Zellen, die sich auch für die Untersuchung von Faktoren eignen, die die mitotische Spindelmontage regulieren. Ein Protokoll zur Analyse von Zellzyklus-Progressionsfehlern wäre ein wichtiges Werkzeug in solchen Studien.
In früher veröffentlichten Protokollen wurden kommerzielle Kits wie das Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit verwendet, das mehrere Reaktionskomponenten und Azidfarbstoffe enthält, die mit einer Vielzahl von Alexa Fluor-Farbstoffen für die EdU-Einarbeitung und -Detektion gekennzeichnet sind10. Die mit solchen Kits gelieferten Reagenzien sind jedoch nicht mit einigen fluoreszierenden Tags kompatibel, die häufig mit sekundären Antikörpern verwendet werden. Dieses EdU-Nachweiskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit im Lieferumfang von Alexa Fluor 647-konjugiertem Azidfarbstoff) wurde in Drosophila Larven-NPBs im dritten Stadium getestet, und die Co-Färbung wurde mit Antikörpern gegen pH3 und Miranda, einem Marker für NBs, versucht. Darüber hinaus wurden Alexa Fluor 568- oder Cy3-markierte sekundäre Antikörper zum Nachweis der Miranda-Markierung auf der Plasmamembran von NBs11verwendet. Die erwartete Signalintensität und das Färbemuster (unveröffentlichte Ergebnisse) wurden jedoch nicht mit diesen sekundären Antikörpern beobachtet, wenn nach dem EdU-Nachweis eine Immunfärbung durchgeführt wurde.
Für die EdU-Einarbeitung erforderte das von Daul und Kollegen beschriebene Protokoll die Fütterung der Larven mit Kankel-White-Medium gemischt mit EdU und Bromphenolblau (BPB)10. Die Larven ernährten sich von der EdU- und BPB-stacheligen Nahrung, die bei der Einnahme im Larvendarm an ihrer blauen Farbe zu erkennen war. Obwohl diese Methode für den EdU-Einbau in Mms19 Loss-of-Function (Mms19P) Larven im dritten Stadium verwendet wurde, haben sich die Mms19P-Larven offenbar nicht verfüttert, da im Larvendarm kaum eine blaue Farbe nachgewiesen wurde (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Mms19P-Larven zeigen drastische Entwicklungsdeformitäten und verhaften schließlich im dritten Stadium des Stadiums. Dies kann das Fressverhalten der Larven im dritten Stadium irgendwie beeinflussen und das EdU-Fütterungsprotokoll für solche Fälle ungeeignet machen.
Nach dem Studium der verfügbaren Literatur und der umfangreichen Arbeit an der Standardisierung wesentlicher Schritte wurde ein alternativer Ansatz für die EdU/pH3-Doppelmarkierung in Drosophila-NBs vorgeschlagen, die keine Fütterung von EdU an Larven erfordert. Eine frühere Studie verwendete eine duale EdU / pH3-Färbung, um den Zellzyklus in NBs zu analysieren, präsentierte jedoch kein detailliertes Protokoll4. Dies stellt eine unnötige Hürde für Labore dar, die versuchen, diese Methode zu implementieren. Darüber hinaus kann die Bewertung der Kompatibilität verschiedener Reagenzien mit dem EdU-Kit und die Durchführung weiterer Optimierungen ein zeitaufwändiger Prozess sein. Dieses Papier stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, das den Einbau von EdU in sezierte Larvengehirne und die Immunfärbung mit Anti-pH3-Antikörpern abdeckt, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse, um NBs vier verschiedenen Kategorien zuzuordnen: G0 / G1-Phase, S-Phase, S>G2 / M (Progression von S zu G2 / M) und M-Phase. Die zu optimierenden Schritte werden beschrieben und Tipps für die Bildanalyse großer Datensätze gegeben. Zusätzlich wird die EdU/pH3-Anzeige in Wildtyp-NBs analysiert und mit Mms19 P-NBs verglichen, von denen kürzlich berichtet wurde, dass sie eine Zellzyklusverzögerung zeigen11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der EdU-Einbau und seine anschließende “Klick”-Reaktion mit zellpermeablem Azid stellen praktische Vorteile dieser Technik gegenüber der zuvor verwendeten BrdU-Methode dar7. Diese Reaktion wird jedoch durch Cu(I)-Ionen katalysiert, und mehrere Farbstoffe können in Gegenwart dieses Kupferkatalysators instabil sein, wie es vom Hersteller des Click-it EdU-Kits eindeutig empfohlen wird. Wenn nach der Ausführung des EdU-Nachweisschritts Immunfärbungsexperimente durchgeführt wurden, wurde die erwa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Schweizerischen Nationalfonds (Projektstipendium 31003A_173188; www.snf.ch) und der Universität Bern (www.unibe.ch) an die BS unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
Referências
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