ड्रोसोफिला न्यूरल स्टेम सेल में सेल साइकिल प्रोग्रेशन एनालिसिस के लिए 5-एथिनाइल-2'-Deoxyuridine/फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 ड्यूल-लेबलिंग प्रोटोकॉल
Summary
5-एथिनाइल-2′-डिऑक्सीयूरिडीन (एडयू) और फॉस्फो-हिस्टोन एच3 (पीएच3) लेबलिंग के साथ सेल चक्र विश्लेषण एक बहु-चरण प्रक्रिया है जिसके लिए व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में कोशिकाओं को अलग करने के लिए छवि विश्लेषण और मात्राकरण सहित इस प्रक्रिया के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है।
Abstract
वीवो सेल चक्र प्रगति विश्लेषण में नियमित रूप से माइटोसिस और डीएनए प्रतिकृति को विनियमित करने वाले जीन पर अध्ययन में किया जाता है। 5-एथिनाइल-2′-डिऑक्सीयूरिडीन (एडयू) का उपयोग प्रतिकृति/एस-चरण प्रगति की जांच करने के लिए किया गया है, जबकि फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग माइटोटिक नाभिक और कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया गया है । दोनों लेबलों के संयोजन से जी0/जी1 (गैप चरण), एस (प्रतिकृति), और एम (माइटोटिक) चरणों का वर्गीकरण संभव होगा और कोशिका चक्र प्रगति पर मिटोटिक जीन नॉकडाउन या नल म्यूटेंट के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम करेगा । हालांकि, एडू-लेबल कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर् थ कई माध्यमिक एंटीबॉडी-फ्लोरोसेंट टैग के साथ असंगत हैं। यह इम्यूनोस्टेपिंग को जटिल बनाता है, जहां प्राथमिक और टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग पीएच 3-सकारात्मक माइटोटिक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। यह पेपर ड्रोसोफिला लार्वा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में एडु और पीएच3 की दोहरी लेबलिंग के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मिटोटिक कारकों का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग की जाने वाली प्रणाली है। इसके अतिरिक्त, छवि विश्लेषण और मात्राकरण के लिए 3 अलग-अलग श्रेणियों, G0/G1, S, S>G2/M (एस से G2/M तक प्रगति) और एम चरणों में लेबल कोशिकाओं को आवंटित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है ।
Introduction
सेल डिवीजन चक्र में एक G1 चरण (पहला अंतर चरण), एक प्रतिकृति/एस-चरण, एक जी-2 (दूसरा अंतर चरण), और एक एम (माइटोटिक) चरण शामिल है । इन चरणों से गुजरते हुए, सेल सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन, अनुवाद और साइटोस्केलेल मशीनरी1,2के पुनः संगठन में नाटकीय परिवर्तन से गुजरता है। विकासात्मक और पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में, कोशिकाएं अस्थायी रूप से विभाजित हो सकती हैं और शांत (G0) बन जाती हैं या अंतर करती हैं और स्थायी रूप से3विभाजित करना बंद कर सकती हैं। डीएनए क्षति जैसे अन्य परिदृश्यों से समय से पहले भेदभाव या एपोप्टोसिस3,4हो सकता है। इस तरह के संकेतों के जवाब को सेल चक्र चौकियों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो विभाजन चक्र5के अगले चरण के लिए सेल द्वारा किए जाने से पहले आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए एक निगरानी प्रणाली के रूप में कार्य करती है। इसलिए, डीएनए प्रतिकृति, चौकियों, और माइटोटिक मशीनरी को विनियमित करने वाले जीन पर अध्ययन के लिए संभावित सेल चक्र प्रगति दोषों का विश्लेषण करने की आवश्यकता है जो उत्परिवर्ती कोशिकाओं में या इन जीनों के सिरना नॉकआउट पर हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, इस तरह के विश्लेषण समग्र सेल स्वास्थ्य के साथ ही दवा उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
5-ब्रोमो-2′-डिऑक्सीयूरिडीन (BrdU) एक थायमिडीन एनालॉग है जिसे प्रतिकृति 6 के दौरान डीएनए में शामिल कियाजाताहै। एस-चरण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस विधि का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया था। हालांकि, कोशिकाओं को तब कठोर डीएनए डेनैचेशन प्रक्रियाओं के अधीन किया जाता है ताकि एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी6के उपयोग के माध्यम से BrdU का पता लगाने की अनुमति दी जा सके। यह कठोर उपचार सेलुलर एपिटोप को नुकसान पहुंचा सकता है और इम्यूनोस्टेपिंग के माध्यम से नमूने के आगे लक्षण वर्णन को रोक सकता है। एडू निगमन और बाद में एक तांबे उत्प्रेरक द्वारा पता लगाने, छोटे, सेल पारगम्य, फ्लोरोसेंटी टैग अज़ाइड रंगों के साथ ‘ क्लिक प्रतिक्रिया ‘ कठोर विकृति प्रक्रियाओं7की आवश्यकता को समाप्त करता है । इसलिए यह विधि बीआरडीयू निगमन के लिए अधिक व्यावहारिक विकल्प के रूप में उभरी ।
इसके अलावा, पीएच3 को माइटोटिक/एम चरण कोशिकाओं8के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में वर्णित किया गया है । हिस्टोन एच 3 एक डीएनए से जुड़ा कोर हिस्टोन प्रोटीन है जो देर से जी2 चरण के आसपास एम चरण में फॉस्फोरिलेटेड हो जाता है और एनाफेज 8 के अंत की ओर डी-फॉस्फोरिलेटेडहोताहै। मानक इम्यूनोस्टेपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीएच3 का पता लगाने के लिए कई वाणिज्यिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। इसलिए एडू और पीएच3 के दोहरे धुंधला होने से एस-फेज के साथ-साथ एम-फेज में कोशिकाओं का पता लगाने में मदद मिलेगी । इसके अतिरिक्त, G1 और जल्दी G2 चरण में कोशिकाओं को मार्कर में से किसी के लिए सकारात्मक दाग नहीं होगा ।
ड्रोसोफिला न्यूरल स्टेम सेल या न्यूरोब्लास्ट (एनबीएस) एक अच्छी तरह से विशेषता वाले स्टेम सेल मॉडल प्रदान करते हैं जिसमें कोशिकाएं विषम रूप से विभाजित होती हैं ताकि एक समान आत्म-नवीनीकरण एनबी और एक गैंगलियन मदर सेल (जीएमसी) का उत्पादन किया जा सके, जो भेदभाव9के लिए होता है। इसके अतिरिक्त, कई आनुवंशिक उपकरण और एनबी-विशिष्ट एंटीबॉडी इस प्रणाली को आनुवंशिक हेरफेर और लाइव-सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त बनाते हैं। नतीजतन, कई अध्ययनों ने एनबीएस का उपयोग असममित विभाजन और कोशिका भाग्य निर्धारण9को विनियमित करने वाले जीनों का अध्ययन करने के लिए किया है । एनबीएस की अलग-अलग आबादी केंद्रीय मस्तिष्क (सीबी) और लार्वा मस्तिष्क9के ऑप्टिक पालि (ओएल) में मौजूद है; सीबी एनबीएस का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था। ये तीसरा इंस्टार लार्वा सीबी एनबीएस बड़ी कोशिकाएं हैं जो माइटोटिक स्पिंडल असेंबली को विनियमित करने वाले कारकों का अध्ययन करने के लिए भी उपयुक्त हैं। सेल चक्र प्रगति दोषों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल ऐसे अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा।
पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में वाणिज्यिक किट नियोजित थे, जैसे क्लिक-आईटी ईडू एलेक्सा फ्लोर सेल प्रसार किट, जो एडू निगमन और डिटेक्शन10के लिए एलेक्सा फ्लोर रंगों की एक किस्म के साथ टैग किए गए कई प्रतिक्रिया घटक और एजाइड रंग प्रदान करते हैं। हालांकि, इस तरह की किट के साथ आपूर्ति किए गए अभिवाक अक्सर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उपयोग किए जाने वाले कुछ फ्लोरोसेंट टैग के साथ संगत नहीं होते हैं। इस EdU डिटेक्शन किट (क्लिक करें-iT EdU Alexa सेल प्रसार किट Alexa Fluor ६४७-conjugated azide डाई के साथ आपूर्ति) Drosophila तीसरे इंस्टार लार्वा एनबीएस में परीक्षण किया गया था, और सह धुंधला pH3 और मिरांडा, एनबीए के लिए एक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ का प्रयास किया गया । इसके अलावा, एलेक्सा फ्लोर 568- या Cy3-टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग एनबीएस11की प्लाज्मा झिल्ली पर मिरांडा लेबलिंग का पता लगाने के लिए किया गया था। हालांकि, एडू डिटेक्शन के बाद इम्यूनोदाता किए जाने पर इन माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अपेक्षित सिग्नल तीव्रता और धुंधला पैटर्न (अप्रकाशित परिणाम) नहीं देखा गया।
एडू निगमन के लिए, दौल और सहयोगियों द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल में एडू और ब्रोमोफेनॉल ब्लू (बीपीबी)10के साथ मिश्रित कंकाल-सफेद माध्यम के साथ लार्वा को खिलाने की आवश्यकता थी। एडू और बीपीबी-नुकीला भोजन पर खिलाया गया लार्वा, जिसे लार्वा आंत में घूस पर इसके नीले रंग से देखा जा सकता है। यद्यपि इस विधि का उपयोग Mms19 हानि-ऑफ-फ़ंक्शन(Mms19P)तीसरे इंस्टार लार्वा में एडू निगमन के लिए किया गया था, लेकिन एमएमएस 19पी लार्वा ने स्पष्ट रूप से फ़ीड नहीं किया क्योंकि लार्वा आंत (अप्रकाशित परिणाम) में शायद ही कोई नीला रंग पाया गया था। Mms19पी लार्वा कठोर विकासात्मक विकृति दिखाते हैं और अंततः तीसरे इंस्टार चरण में गिरफ्तार होते हैं। यह किसी भी तरह तीसरे इंस्टार लार्वा के खिला व्यवहार को प्रभावित कर सकता है और ऐसे मामलों के लिए एडू-फीडिंग प्रोटोकॉल अनुपयुक्त प्रदान कर सकता है।
उपलब्ध साहित्य का अध्ययन करने और आवश्यक कदमों के मानकीकरण पर बड़े पैमाने पर काम करने के बाद, ड्रोसोफिला एनबीएस में एडयू/पीएच3 दोहरी लेबलिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया था, जिसमें लार्वा को एडु खिलाने की आवश्यकता नहीं है । एक पिछले अध्ययन दोहरी EdU कार्यरत/pH3 NBs में सेल चक्र का विश्लेषण करने के लिए धुंधला है, लेकिन एक विस्तृत प्रोटोकॉल4पेश नहीं किया । यह इस विधि को लागू करने की कोशिश कर प्रयोगशालाओं के लिए एक अनावश्यक बाधा प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, एडू किट के साथ विभिन्न अभिकर्मकों की अनुकूलता का मूल्यांकन करना और आगे अनुकूलन करना एक समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है। यह पत्र एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो विच्छेदित लार्वा दिमाग में एडू निगमन को शामिल करता है और एंटी-पीएच3 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसटेनिंग करता है, जिसके बाद चार अलग-अलग श्रेणियों में एनबी आवंटित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण किया जाता है: G0/G1 चरण, एस चरण, एस>G2/M (एस से जी2/एम तक प्रगति), और एम चरण । अनुकूलन की आवश्यकता वाले चरणों को रेखांकित किया जाता है और बड़े डेटासेट के छवि विश्लेषण के लिए दिए गए सुझाव दिए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, जंगली प्रकार के एनबीएस में EdU/pH3 readout का विश्लेषण किया जाता है और Mms19पी एनबीएस के साथ तुलना की जाती है, जिसे हाल ही में सेल चक्र देरी11दिखाने की सूचना दी गई थी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU निगमन और इसके बाद सेल-पारमी azide के साथ प्रतिक्रिया BrdU विधि पर इस तकनीक के व्यावहारिक लाभ प्रस्तुत करता है7पहले इस्तेमाल किया । हालांकि, इस प्रतिक्रिया को Cu (I) आयनों द्वारा उत्प्रेरित किया जाता ह…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (प्रोजेक्ट ग्रांट 31003A_173188; www.snf.ch) और यूनिवर्सिटी ऑफ बर्न (www.unibe.ch) से बी एस को फंडिंग से सपोर्ट मिला । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, पांडुलिपि को प्रकाशित करने या तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
Referências
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
