5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル
Summary
5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。
Abstract
生体細胞 周期進行解析は、有糸分裂およびDNA複製を調節する遺伝子に関する研究において日常的に行われている。5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)は、複製/S相進行を調査するために利用されているのに対し、ホスホヒストンH3に対する抗体は、有核および細胞をマークするために利用されてきた。両方のラベルの組み合わせは、G0/G1(ギャップフェーズ)、S(複製)、およびM(有糸分裂)相の分類を可能にし、有糸分裂遺伝子のノックダウンまたはヌル突然変異体が細胞周期進行に及ぼす影響を評価する重要なツールとして機能する。しかし、EdU標識細胞をマークするために使用される試薬は、いくつかの二次抗体蛍光タグと互換性がありません。これは、一次およびタグ付き二次抗体がpH3陽性有糸分裂細胞をマークするために使用される免疫染色を複雑にします。本論文では、染色体 の幼虫 神経幹細胞におけるEdUとpH3の二重標識のステップバイステッププロトコルについて説明する。さらに、画像分析と定量化のために、G0/G1、S、S、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の3つの異なるカテゴリーにラベル付けされたセルを割り当てるためのプロトコルが用意されています。
Introduction
細胞分割サイクルは、G1相(第1ギャップ相)、複製/S相、G2(第2ギャップ相)、M(ミトティック)相で構成されています。これらの段階を経て、細胞は細胞転写、翻訳、および細胞骨格機構1,2の再構成において劇的な変化を起こします。発達的および環境的な手掛かりに応じて、細胞は一時的に分裂を停止し、静止(G0)になるか、分化し、永久に3を分割しなくなる。DNA損傷などの他のシナリオでは、早期分化またはアポトーシス3,4を引き起こす可能性があります。このようなキューへの応答は、細胞周期チェックポイントによって仲介され、細胞が分割サイクル5の次の段階にコミットする前に、本質的な細胞プロセスの完全性を確保するための監視システムとして機能する。したがって、DNA複製、チェックポイント、および有糸分裂性機械を調節する遺伝子に関する研究では、変異細胞またはこれらの遺伝子のsiRNAノックダウン時に起こり得る細胞周期進行欠陥を分析する必要があります。さらに、このような分析は、全体的な細胞の健康だけでなく、薬物治療に対する細胞応答をテストするために使用することができます。
5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)は、複製中にDNAに組み込まれるチミジンアナログ6.この方法は、S相の細胞を同定するために広く使用された。しかし、細胞は、抗BrdU抗体6を用いてBrdUを検出できるように、過酷なDNA変性手順を行う。この過酷な治療は、細胞エピトープを損傷し、免疫染色を介してサンプルのさらなる特性を防ぐことができます。銅触媒によるEdUの組み込みおよびその後の検出は、小さく、細胞透過性、蛍光タグ付きアジド染料による「クリック反応」は、過酷な変性手順7の必要性を排除する。したがって、この方法は、BrdUの組み込みに代わるより実用的な代替手段として浮上した。
また、pH3は、有糸分裂/M相細胞8に対する信頼できるマーカーとして説明されている。ヒストンH3は、G2後期から初期のM相の周囲でリン酸化されて、アナフェーズ8の終わりに向かって脱リン酸化されるDNA関連コアヒストンタンパク質である。いくつかの市販の抗体を使用して、標準的な免疫染色プロトコルを使用してpH3を検出することができます。したがって、EdUとpH3の二重染色は、M相と同様にS相の細胞の検出を可能にするであろう。さらに、G1およびG2初期期の細胞は、いずれのマーカーにも積極的に染色されないであろう。
ショウジョウバエ 神経幹細胞または神経芽細胞(NBs)は、細胞が非対称的に分裂して1つの同一の自己更新NBおよび神経節母細胞(GMC)を産生する、分化9のために運命づけられた十分に特徴付けられる幹細胞モデルを提供する。さらに、いくつかの遺伝子ツールとNB特異的抗体は、このシステムを遺伝子操作および生細胞イメージングに適しています。その結果、いくつかの研究は、非対称分裂および細胞運命決定9を調節する遺伝子を研究するためにNBを利用した。脳の中枢(CB)と幼虫脳の視頭葉(OL)に、異なる集団が存在する。CB NBは、現在の研究のために使用されました.これら第3のインスター幼虫CB NBは、有糸分裂性紡錘の組立を調節する因子を研究するのにも適している大細胞である。細胞周期の進行欠陥を分析するプロトコルは、このような研究において重要なツールとなるだろう。
先に公開されたプロトコルは、Click-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キットのような商用キットを採用しており、EdUの組み込みおよび検出用の様々なアレクサフルオール染料でタグ付けされたいくつかの反応成分とアジド染料を提供する。しかし、このようなキットに付属の試薬は、二次抗体とよく使用される蛍光タグと互換性がありません。このEdU検出キット(アレクサフルオール647-共役アジジド色素を供給するClick-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キット)をショ ウジョウバエ 第3のインスター幼虫NBで試験し、NBのマーカーであるpH3およびミランダに対する抗体を共染色実験した。また、Alexa Fluor 568-またはCy3タグ付き二次抗体をNBs11の血漿膜上でのミランダ標識の検出に用いた。しかし、期待されるシグナル強度および染色パターン(未発表の結果)は、EdU検出後に免疫染色を行った場合、これらの二次抗体では観察されなかった。
EdUの組み込みについては、DaulとDaulと同僚が説明したプロトコルは、EdUとブロモフェノールブルー(BPB)10と混合されたカンケル白培地で幼虫の供給を必要とした。幼虫は、幼虫の腸内で摂取すると青い色で見ることができるEdUとBPBスパイク食品に餌を与えました。この方法は、第3のインスター幼虫であるMms19機能喪失(Mms19P)のEdU組み込みには用いられたが、幼虫の腸内で青色の色がほとんど検出されなかったため、Mms19P幼虫は明らかにほとんど供給されなかった(未発表の結果)。Mms19P幼虫は劇的な発達の変形を示し、最終的に第3のインスター段階で逮捕する。これは、第3のインスター幼虫の摂食行動に何らかの影響を及ぼし、そのような場合にはEdU-給餌プロトコルを不適当にする可能性がある。
利用可能な文献を研究し、本質的なステップの標準化に広く取り組んだ後、幼虫にEdUを供給する必要のないショウジョウバエNBsのEdU / pH3デュアルラベリングのための代替アプローチが提案されました。以前の研究では、NBsの細胞周期を分析するために二重EdU / pH3染色を採用したが、詳細なプロトコル4は示さなかった。これは、このメソッドを実装しようとするラボにとって、不要なハードルを示します。さらに、各種試薬とEdUキットとの相溶性を評価し、さらなる最適化を行う場合には、時間のかかる処理が可能です。この論文では、解剖された幼虫脳におけるEdUの組み込みと抗pH3抗体による免疫染色をカバーするステップバイステップのプロトコルを提示し、続いて共焦点顕微鏡と画像分析を行い、G0/G1相、S相、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の4つのカテゴリーにNBを割り当てる。最適化が必要な手順の概要と、大規模データセットの画像分析に関するヒントが示されています。さらに、野生型のNBsにおけるEdU/pH3読み出しは、分析され、最近報告されたMms19P NBsと比較され、細胞周期遅延11を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU の組み込みとその続く細胞透過性アジドとの “クリック” 反応は、前の7で使用した BrdU メソッドよりもこの手法の実用的な利点を提示します。しかし、この反応はCu(I)イオンによって触媒され、いくつかの色素は、この銅触媒の存在下で不安定である可能性があり、Click-it EdUキットメーカーによって明確に助言される。EdU検出ステップを実行した後に免疫染色実験を行っ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スイス国立科学財団(プロジェクト補助金31003A_173188;www.snf.ch)とベルン大学(www.unibe.ch)からBSへの資金提供によって支えられました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
Referências
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