5-этинил-2'-дезоксиуридин / фосфо-гистон H3 Двойной протокол маркировки для анализа прогрессирования клеточного цикла в нервных стволовых клетках дрозофилы

Summary

Анализ клеточного цикла с маркировкой 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU) и фосфогистона H3 (pH3) является многоэтапной процедурой, которая может потребовать обширной оптимизации. Здесь мы представляем подробный протокол, который описывает все этапы этой процедуры, включая анализ изображений и количественную оценку для различения клеток в разных фазах клеточного цикла.

Abstract

Анализ прогрессирования клеточного цикла in vivo обычно проводится в исследованиях генов, регулирующих митоз и репликацию ДНК. 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) был использован для исследования репликативного / S-фазного прогрессирования, тогда как антитела против фосфогистона H3 были использованы для маркировки митотических ядер и клеток. Комбинация обеих меток позволит классифицировать фазы G0 /G1 (фаза разрыва), S (репликативная) и M (митотическая) фазы и послужит важным инструментом для оценки влияния митотических нокдаунов генов или нулевых мутантов на прогрессирование клеточного цикла. Однако реагенты, используемые для маркировки клеток, меченных EdU, несовместимы с несколькими вторичными антителами-флуоресцентными метками. Это усложняет иммуноокрашивание, когда первичные и меченые вторичные антитела используются для маркировки pH3-положительных митотических клеток. В этой статье описывается пошаговый протокол двойной маркировки EdU и pH3 в нервных стволовых клетках личинок Drosophila, система, широко используемая для изучения митотических факторов. Кроме того, предоставляется протокол для анализа и количественной оценки изображений для выделения меченых клеток в 3 различных категориях: G0/ G1, S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и M фаз.

Introduction

Цикл деления клеток включает фазу G1 (первая фаза зазора), репликативную/S-фазу, G2 (вторая фаза разрыва) и M(митотическую) фазу. Проходя через эти фазы, клетка претерпевает драматические изменения в клеточной транскрипции, трансляции и реорганизации цитоскелетного аппарата^1,2. В ответ на сигналы развития и окружающей среды клетки могут временно перестать делиться и становиться покоящимися (G0) или дифференцироваться и постоянно переставать делиться^3. Другие сценарии, такие как повреждение ДНК, могут вызвать преждевременную дифференцировку или апоптоз^3,4. Реакция на такие сигналы опосредована контрольными точками клеточного цикла, которые действуют как система наблюдения для обеспечения целостности основных клеточных процессов до того, как клетка перейдет к следующей фазе цикла деления^5. Поэтому исследования генов, регулирующих репликацию ДНК, контрольные точки и митотический механизм, должны анализировать возможные дефекты прогрессирования клеточного цикла, которые могут возникать в мутантных клетках или при нокдауне siRNA этих генов. Кроме того, такие анализы могут быть использованы для проверки общего здоровья клеток, а также клеточных реакций на медикаментозное лечение.

5-бром-2′-дезоксиуридин (BrdU) является аналогом тимидина, который включается в ДНК во время репликации^6. Этот метод широко использовался для идентификации клеток в S-фазе. Однако затем клетки подвергаются жестким процедурам денатурации ДНК, чтобы позволить обнаружить BrdU с помощью антител против BrdU^6. Это жесткое лечение может повредить клеточные эпитопы и предотвратить дальнейшую характеристику образца путем иммуноокрашивания. Включение EdU и последующее обнаружение катализируемой медью «щелкающей реакции» с небольшими, проницаемыми клетками, флуоресцентно мечеными азидными красителями устраняет необходимость в жестких процедурах денатурации^7. Таким образом, этот метод стал более практичной альтернативой инкорпорации BrdU.

Кроме того, pH3 был описан как надежный маркер для митотических /М фазовых клеток^8. Гистон H3 представляет собой ДНК-ассоциированный основной гистоновый белок, который фосфорилируется примерно в конце фазы G2 до ранней фазы M и дефосфорилируется к концу анафазы^8. Несколько коммерческих антител могут быть использованы для обнаружения pH3 с использованием стандартных протоколов иммуноокрашения. Таким образом, двойное окрашивание EdU и pH3 позволит обнаруживать клетки как в S-фазе, так и в М-фазе. Кроме того, клетки в фазе G1 и ранней фазе G2 не окрашиваются положительно ни для одного из маркеров.

Нервные стволовые клетки Drosophila или нейробласты (NB) предлагают хорошо охарактеризованную модель стволовых клеток, в которой клетки делятся асимметрично, чтобы произвести один идентичный самообновляющийся NB и ганглиозную материнскую клетку (GMC), которая предназначена для дифференцировки^9. Кроме того, несколько генетических инструментов и NB-специфических антител делают эту систему подходящей для генетических манипуляций и визуализации живых клеток. Следовательно, в нескольких исследованиях использовались NB для изучения генов, регулирующих асимметричные деления и определение судьбы клеток^9. Различные популяции NB существуют в центральном мозге (CB) и зрительной доле (OL) личиночного мозга^9; Для текущего исследования использовались CB NB. Эти третьи личинки CB NB представляют собой крупные клетки, которые также подходят для изучения факторов, регулирующих сборку митотического веретена. Протокол для анализа дефектов прогрессирования клеточного цикла будет жизненно важным инструментом в таких исследованиях.

Протоколы, опубликованные ранее, использовали коммерческие наборы, такие как Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, которые предоставляют несколько реакционных компонентов и азидных красителей, помеченных различными красителями Alexa Fluor для включения и обнаружения^{EdU 10.} Однако реагенты, поставляемые с такими наборами, не совместимы с некоторыми флуоресцентными метками, часто используемыми со вторичными антителами. Этот набор для обнаружения EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, поставляемый с Alexa Fluor 647-конъюгированным азидным красителем) был протестирован на Drosophila third instar NB, и было предпринято совместное окрашивание антителами против pH3 и Miranda, маркером для NB. Кроме того, вторичные антитела, помеченные Alexa Fluor 568 или Cy3, были использованы для обнаружения маркировки Miranda на плазматической мембране NBs^11. Однако ожидаемая интенсивность сигнала и картина окрашивания (неопубликованные результаты) не наблюдались с этими вторичными антителами при иммуноокрашивании после обнаружения EdU.

Для включения EdU протокол, описанный Даулом и его коллегами, требовал кормления личинок средой Канкеля-Уайта, смешанной с EdU и бромфеноловым синим (BPB)^10. Личинки питались пищей с шипами EdU и BPB, что можно было увидеть по их синему цвету при проглатывании в личиночном кишечнике. Хотя этот метод был использован для включения EdU в mms19 потеря функции(Mms19^P)третьими личинками звезды, личинки Mms19^P, по-видимому, не питались, поскольку в личиночной кишке почти не было обнаружено синего цвета (неопубликованные результаты). Личинки Mms19^P демонстрируют резкие деформации развития и в конечном итоге останавливаются на третьей стадии. Это может каким-то образом повлиять на пищевое поведение личинок третьей звезды и сделать протокол кормления EdU непригодным для таких случаев.

После изучения имеющейся литературы и обширной работы над стандартизацией основных этапов был предложен альтернативный подход для двойной маркировки EdU/pH3 у Drosophila NBs, которая не требует кормления EdU личинкам. Предыдущее исследование использовало двойное окрашивание EdU/pH3 для анализа клеточного цикла в NB, но не представило подробного протокола^4. Это представляет собой ненужное препятствие для лабораторий, пытающихся реализовать этот метод. Кроме того, оценка совместимости различных реагентов с комплектом EdU и выполнение дальнейшей оптимизации могут быть трудоемким процессом. В этой статье представлен пошаговый протокол, который охватывает включение EdU в рассеченный личиночный мозг и иммуноокрашивание антителами против pH3, за которым следует конфокальная микроскопия и анализ изображений для выделения NB по четырем различным категориям: фаза G0 / G1, фаза S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и фаза M. Описаны шаги, требующие оптимизации, и приведены советы по анализу изображений больших наборов данных. Кроме того, анализируются показания EdU/pH3 в НБ дикого типа и сравниваются с Mms19^P NB, которые, как недавно сообщалось, показывают задержку клеточного цикла^11.

Protocol

1. Подготовка реагентов и запасов для анализа Click-it EdU ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о комплекте и реагентах, поставляемых с комплектом, см. в Таблице материалов и Таблице 1. Доведите флаконы до комнатной температуры перед приготовлением растворо…

Representative Results

Двулопастный мозг drosophila third instar larval был использован в качестве модельной системы для изучения фундаментальных клеточных процессов и процессов развития9. Основное внимание в текущем исследовании было уделено представлению протокола для анализа прогрессирования клет…

Discussion

Инкорпорация EdU и ее последующая «щелкающая» реакция с проницаемым в клетки азидом представляют практические преимущества этой методики по сравнению с методом BrdU, используемым^{ранее 7.} Однако эта реакция катализируется ионами Cu(I), и некоторые красители могут быть нестабил?…

Materials

fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper