Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Summary

Este protocolo descreve um novo ensaio de intensificador-repórter transitório baseado em rAAV. Este ensaio pode ser usado para induzir a expressão impulsionada por potenciadores in vivo no cérebro do rato.

Abstract

Os potenciadores são plataformas de ligação para uma gama diversificada de fatores de transcrição que impulsionam padrões de expressão específicos de genes específicos de tecidos e células. Múltiplos meios de avaliar o DNA não codificante e vários estados de cromatina provaram ser úteis para prever a presença de sequências potencializadoras no genoma, mas validar a atividade dessas sequências e encontrar os órgãos e estágios de desenvolvimento em que estão ativas é um processo trabalhoso. Avanços recentes em vetores de vírus adenoassociados (AAV) permitiram a entrega generalizada de transgenes aos tecidos de camundongos, permitindo testes de potenciadores in vivo sem a necessidade de um animal transgênico. Este protocolo mostra como um construto de repórter que expressa EGFP sob o controle de um promotor mínimo, que não conduz a expressão significativa por si só, pode ser usado para estudar os padrões de atividade de sequências de potenciadores candidatos no cérebro do rato. Uma construção de repórter embalada em AAV é entregue ao cérebro do rato e incubada por 1-4 semanas, após o que o animal é sacrificado e seções cerebrais são observadas sob um microscópio. O EGFP aparece em células nas quais o potenciador testado é suficiente para iniciar a expressão gênica, identificando a localização e o estágio de desenvolvimento em que o potenciador está ativo no cérebro. Métodos de clonagem padrão, embalagem de AAV de baixo custo e sorotipos e métodos de AAV em expansão para entrega in vivo e leitura de imagem padrão tornam esta uma abordagem acessível para o estudo de como a expressão gênica é regulada no cérebro.

Introduction

Os potenciadores são elementos cis-reguladores genômicos que servem como sítios de ligação do fator de transcrição e podem conduzir a expressão de um gene alvo de maneira espaço-temporalmente específica ^1,2. Eles são diferencialmente ativos em diferentes tipos celulares, tecidos e estágios de desenvolvimento e podem ser substratos da variação genômica relacionada ao risco de doença ^3,4. Assim, a necessidade de entender a dinâmica da função do potenciador é fundamental para o progresso em aplicações translacionais e científicas básicas dentro da genômica. Previsões in silico de atividade potenciadora podem servir como excelentes recursos para gerar hipóteses quanto à capacidade potencializadora ^5,6. Tal atividade potenciadora prevista pode exigir validação e interrogação adicionais para uma compreensão completa da atividade funcional. Os ensaios do Enhancer Reporter têm se mostrado valiosos para esse fim em uma variedade de sistemas, de células a animais ^7,8,9. No sentido de estender esses estudos em um contexto transiente in vivo flexível e econômico, este protocolo descreve o uso de métodos baseados em AAV in vivo para testar supostas sequências potenciadoras de sua capacidade de conduzir a expressão de um gene repórter ectópico no cérebro de camundongo pós-natal. Essa família de métodos tem utilidade para interrogar sequências candidatas únicas ou triagem paralela de bibliotecas e é relevante para pesquisas básicas e translacionais.

Este método combina em um único plasmídeo uma suposta sequência de DNA candidato a potenciador com um gene repórter (aqui EGFP), sob o controle de um promotor mínimo que por si só não conduz a expressão significativa. O plasmídeo é embalado em AAV recombinante (rAAV) e injetado em um modelo animal. Embora a aplicação aqui seja para o cérebro, vários sorotipos de rAAV permitem a infecção em diferentes tipos de tecidos, de modo que essa abordagem pode ser estendida a outros sistemas¹⁰. Após um período de tempo, o cérebro pode ser coletado e ensaiado para a expressão do gene repórter. A expressão forte, comparada aos controles, indica que a sequência candidata testada foi capaz de “aprimorar” a expressão do gene (Figura 1). Este design simples oferece uma abordagem fácil e clara para testar uma sequência de atividade potenciadora in vivo no cérebro.

Além de testar a capacidade de potenciador de uma sequência, este método pode ser combinado com técnicas para determinar a atividade do potenciador do tipo celular. Em abordagens baseadas em sequências para determinar a atividade diferencial do potenciador, a classificação de células em marcadores específicos do tipo celular antes do sequenciamento de DNA e RNA pode permitir que os pesquisadores determinem se diferentes tipos de células apresentam atividade diferencial do potenciador, como foi descrito em Gisselbrecht et ^al.11. Em abordagens baseadas em imagens, a co-marcação de imagens com marcadores específicos do tipo celular permite examinar se as células que exibem fluorescência impulsionada por potenciador também exibem marcadores do tipo celular de interesse 12,13,14,15,16. Os ensaios do repórter Enhancer permitem o teste direto da variação alélica associada ao risco em potenciadores para efeitos sobre a capacidade do potenciador. A grande maioria dos loci de risco identificados em estudos de associação genômica ampla (GWAS) encontra-se em regiões não codificantes do genoma¹⁷. Estudos de anotação funcional desses loci de risco indicam que uma grande parcela provavelmente atua como potenciadores^18,19,20. A implantação in vivo do MPRA pode permitir o teste dessas variantes associadas ao risco para a atividade potencializadora no cérebro^12,21. Finalmente, a entrega e a coleta em diferentes pontos de tempo podem oferecer insights sobre os estágios de desenvolvimento durante os quais um intensificador está ativo.

Os projetos de plasmídeos do Enhancer-reporter são diversos e podem ser personalizados para atender aos objetivos experimentais. Existem várias opções para promotores mínimos que têm sido utilizados na pesquisa de potenciadores, como o promotor mínimo de β-globina humana²² e o promotor mínimo Hsp68 do rato²³. Esses promotores são conhecidos por conduzir baixos níveis de expressão, a menos que combinados com um elemento potenciador para ativá-los. Em contraste, os elementos promotores constitutivos impulsionam uma forte expressão do transgene, útil para o controle positivo ou para testar a função potenciadora em um contexto de expressão robusta. As escolhas comuns para promotores constitutivos incluem CAG, um promotor híbrido derivado do promotor de β-actina de frango e do potenciador imediato-precoce do citomegalovírus²⁴, ou EF1α²⁵ humano. Como os intensificadores são conhecidos por trabalhar bidirecionalmente²⁶, a orientação e a localização do intensificador em relação ao promotor mínimo são flexíveis (Figura 2A). Os ensaios tradicionais de intensificador-repórter colocam o intensificador a montante do promotor e, nas entregas da biblioteca, incluem uma sequência de código de barras a jusante do gene do repórter para associar as leituras de sequenciamento ao intensificador testado²⁷. No entanto, os intensificadores também podem ser colocados no quadro de leitura aberto do gene repórter e servir como sua própria sequência de código de barras, como é feito no STARR-seq²⁸. O protocolo descrito aqui utiliza o desenho do ensaio STARR-seq, colocando a sequência de potenciadores candidatos na UTR de 3′ do gene repórter. Embora a orientação STARR-seq ofereça o benefício de uma clonagem mais simplificada, ela é menos bem compreendida do que a abordagem convencional e pode induzir a estabilidade variável do RNA entre construtos. Os métodos descritos podem ser facilmente adaptados à orientação STARR-seq ou convencional com pequenas alterações no processo de clonagem descritas em outros lugares^27,29.

Diferentes métodos de entrega de AAV podem ser empregados para personalizar ainda mais essa técnica para se adequar aos objetivos experimentais (Figura 2B). As injeções intracranianas diretas, descritas mais adiante neste protocolo, fornecem uma alta concentração de vírus diretamente ao cérebro³⁰. Isso proporciona uma alta eficiência de transdução centrada no local da injeção, tornando esta uma excelente técnica para experimentos que procuram maximizar a densidade das células transduzidas sobre uma área de tecido. A injeção estereotáxica pode ajudar a padronizar o local de injeção em animais para transdução localizada reprodutível. As injeções intracranianas são mais simples em animais pós-natais precoces. Como técnica alternativa, as injeções sistêmicas podem fornecer transgenes usando AAVs com sorotipos capazes de atravessar a barreira hematoencefálica³¹. As injeções na veia caudal permitem que o vírus circule por todo o corpo, permitindo a entrega generalizada em muitos tecidos¹⁰. As injeções retroorbitais são outra técnica de injeção sistêmica que entrega o vírus atrás do olho no seio retroorbital³². Isso oferece uma rota mais direta para o AAV do sistema venoso para o cérebro, resultando em uma maior concentração de células transduzidas no cérebro do que injeções em vasos sanguíneos mais periféricos³³.

Outro aspecto flexível dessa técnica é o método de leitura. Em termos gerais, as opções podem ser descritas como baseadas em repórter ou em sequenciamento (Figura 2C). A incorporação de um repórter fluorescente, como a GFP, no quadro de leitura aberto do construto resulta na expressão da proteína fluorescente em quaisquer células transduzidas em que o potenciador candidato impulsionou a expressão. Técnicas de marcação e imagem, como a imuno-histoquímica, permitem a amplificação do sinal. As técnicas de leitura baseadas em sequenciamento envolvem a identificação de sequências do construto entregue no RNA coletado do tecido. Ao quantificar a quantidade de DNA viral que foi inicialmente entregue, a comparação de RNA expresso versus DNA entregue pode ser usada para determinar o grau em que uma sequência de potenciador testada foi capaz de impulsionar o aumento da expressão do transgene, por exemplo, no contexto de um ensaio de repórter massivamente paralelo (MPRA). Os MPRAs oferecem uma poderosa expansão dessas técnicas para testar até milhares de potenciadores candidatos para atividade simultaneamente e têm sido amplamente descritos em pesquisas genômicas 12,27,34,35,36. A triagem de taxa de transferência mais alta é alcançada executando etapas de clonagem, empacotamento, entrega e sequenciamento para potenciadores candidatos em lote, em vez de individualmente.

A seleção do potencializador de candidatos oferece outra oportunidade de flexibilidade (Figura 2D). Por exemplo, este ensaio pode ser usado para identificar potenciadores de um gene específico, para determinar a função de regiões de DNA não codificantes de interesse, ou para determinar tipos específicos de células ou estágios de desenvolvimento durante os quais um potenciador está ativo – todos os quais servem a objetivos tanto na ciência básica quanto na pesquisa de doenças. Geralmente, a seleção do potenciador de candidatos é impulsionada por previsões in silico da atividade do potenciador. Comumente, as previsões in silico incluem ChIP-seq para modificações de histonas que indicam prováveis potenciadores, como H3K27ac³⁷ e mapeamento de acessibilidade à cromatina³⁸. Finalmente, uma área crescente de pesquisa é a triagem baseada em função de elementos potenciadores sinteticamente projetados, permitindo estudos de como a sequência do intensificador direciona a função³⁹ e o projeto de intensificadores com propriedades específicas⁴⁰.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis (Protocolo #22339) e pelo Comitê de Biossegurança Institucional da UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo foi testado em camundongos C57BL/6J de ambos os sexos no dia pós-natal 0-1. 1. Clone a sequência candidata potenciadora no plasmídeo vetorial AAV. Observação : os protocolos representativos são fornecidos, mas a estratégia de clonagem tem um alto…

Representative Results

Usando esses métodos, uma sequência de 915 pb no terceiro íntron associado ao risco psiquiátrico do gene CACNA1C19,49,50 foi testada quanto à atividade potencializadora no cérebro de camundongos pós-natais. Esta sequência foi descoberta em um MPRA de 345 sequências de potenciadores candidatos centrados em SNPs de risco psiquiátrico e neurológico12 e os experimentos de caracterização …

Discussion

Este protocolo descreve um método baseado em rAAV para a implantação de transgenes impulsionados por potenciadores no cérebro de camundongos pós-natais. Neste protocolo generalizado, um potenciador candidato, um promotor mínimo, um gene repórter e uma sequência de código de barras opcional são clonados em uma espinha dorsal do plasmídeo AAV. Esses experimentos podem ser feitos com uma única sequência de potenciador de candidatos ou com muitas sequências em paralelo. O plasmídeo é embalado em um rAAV e ent…

Materials

10x Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'	Integrated DNA Technologies	N/A: Custom designed	Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'	Integrated DNA Technologies	N/A: Custom designed	Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose	VWR	VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes	Thermo Fisher Scientific	08-757-100D
Carbenicillin	Sigma-Aldrich	C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP	Thermo Fisher Scientific	A10262
Confocal microscope	Zeiss	LSM900	The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL	Thermo Fisher Scientific	12-565-269
Cryomolds	Thermo Fisher Scientific	NC9806558	These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5"	VWR	82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488	Jackson ImmunoResearch	703-545-155
Dulbecco's PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL	Thermo Fisher Scientific	352059
Fast Green dye	Grainger	F0099-1G
Fine detail paint brush set	Artbrush Tower	B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Glass capillary tubes	Drummond Scientific Company	5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12663	Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water	VWR	SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle	Thermo Fisher Scientific	26708
Kimwipes	Kimberly Clark	34155	Lint-free wipe
LB Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor	Integra LifeSciences	360-215
Mineral oil	Sigma Life Science	69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli	NEB	C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up	Takara	740609.5	Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium	VWR	25608-930
Orbital shaker	Cole Parmer	60-100
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL	VWR	490003-692
Peristaltic pump	Gilson	F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x	Thermo Fisher Scientific	70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F549L
Powdered milk	Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
rCutSmart Buffer	NEB	B6004S	Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI	NEB	R0558L
Restriction enzyme: PacI	NEB	R0547L
Restriction enzyme: XmaI	NEB	R0180L
SOC outgrowth medium	NEB	B0920S	Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free)	Millipore Sigma	033522.5KG
TAE buffer	Apex	20-194
Transfer tubing	Gilson	F1179941	For peristaltic pump
Triton X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Thermo Fisher Scientific	A1460	Plasmid mini prep kit