Rumlig profilering af protein- og RNA-ekspression i væv: En tilgang til finjustering af virtuel mikrodissektion
Summary
Her beskriver vi en protokol til finjustering af interesseområder (ROI’er) for rumlige omikteknologier for bedre at karakterisere tumormikromiljøet og identificere specifikke cellepopulationer. For proteomics-assays kan automatiserede tilpassede protokoller guide ROI-valg, mens transkriptomics-assays kan finjusteres ved hjælp af ROI’er så små som 50 μm.
Abstract
Multiplexing muliggør vurdering af flere markører på det samme væv, samtidig med at der gives rumlig kontekst. Rumlige Omics-teknologier tillader både protein- og RNA-multiplexing ved at udnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-mærkede antistoffer og sonder. Oligos spaltes og kvantificeres fra bestemte regioner på tværs af vævet for at belyse den underliggende biologi. Her viser undersøgelsen, at automatiserede brugerdefinerede antistofvisualiseringsprotokoller kan bruges til at guide ROI-valg i forbindelse med rumlige proteomics-assays. Denne specifikke metode viste ikke acceptabel ydeevne med rumlige transkriptomiske assays. Protokollen beskriver udviklingen af et 3-plex immunofluorescerende (IF) assay til markørvisualisering på en automatiseret platform ved hjælp af tyramidsignalforstærkning (TSA) til at forstærke fluorescerende signal fra et givet proteinmål og øge antistofpuljen at vælge imellem. Visualiseringsprotokollen blev automatiseret ved hjælp af et grundigt valideret 3-plex-assay for at sikre kvalitet og reproducerbarhed. Derudover blev udvekslingen af DAPI for SYTO-farvestoffer evalueret for at muliggøre billeddannelse af TSA-baserede IF-assays på den rumlige profileringsplatform. Derudover testede vi evnen til at vælge små ROI’er ved hjælp af det rumlige transkriptomiske assay for at muliggøre undersøgelse af meget specifikke interesseområder (f.eks. Områder beriget til en given celletype). ROI’er på 50 μm og 300 μm diameter blev indsamlet, hvilket svarer til henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver blev lavet i biblioteker og sekventeret for at undersøge evnen til at detektere signaler fra små ROI’er og profilspecifikke områder af vævet. Vi fastslog, at rumlige proteomics-teknologier i høj grad drager fordel af automatiserede, standardiserede protokoller til at guide ROI-valg. Selvom denne automatiserede visualiseringsprotokol ikke var kompatibel med rumlige transkriptomiske assays, var vi i stand til at teste og bekræfte, at specifikke cellepopulationer med succes kan detekteres selv i små ROI’er med standard manuel visualiseringsprotokol.
Introduction
Fremskridt inden for multiplexingteknikker fortsætter med at give bedre karakteriseringsværktøjer til mål, der er til stede i tumorer. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system af tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor rumlig information er afgørende for bedre at forstå og fortolke mekanismer for interaktion mellem biomarkører af interesse1. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium kan flere mål detekteres og kvantificeres samtidigt inden for deres rumlige kontekst. Brugen af immunfluorescensprotokoller, der letter vævsvisualisering, kan yderligere forbedre disse teknologiers rumlige profileringskapacitet.
Den Spatial Omics-teknologi, vi fokuserede på til denne metodeudvikling, består af rumlig proteomics og transcriptomics assays, hvor oligonukleotider er bundet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-følsom fotospaltbar linker. Histologiske dias mærkes med disse oligo-konjugerede antistoffer eller sonder og afbildes derefter på den rumlige profileringsplatform. Dernæst vælges ROI’er i forskellige størrelser og former til belysning, og de fotospaltede oligonukleotider aspireres og opsamles i en 96-brøndplade. De fotospaltede oligonukleotider fremstilles til kvantificering med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (figur 1)4,5.
Cellefordelinger varierer inden for væv, og evnen til at karakterisere specifikke placeringer af celler ved hjælp af udvalgte markører og forskellige ROI-størrelser er af stor betydning for fuldt ud at forstå vævsmiljøet og identificere specifikke træk. I den her nævnte Spatial Omics-teknologi bruger standardvisualiseringsprotokollen direkte konjugerede antistoffer og er en manuel protokol. Standardmarkørerne til at skelne mellem tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD456,7, men yderligere markører er nødvendige for at målrette mod specifikke cellepopulationer af interesse. Desuden mangler brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer amplifikation, hvilket begrænser antistofudvælgelsen til rigelige markører. Derudover er manuelle analyser underlagt større variabilitet end automatiserede arbejdsgange8. Derfor er det ønskeligt at have en tilpasselig, automatiseret og forstærket visualiseringsprotokol til ROI-valg.
Her viser undersøgelsen, at TSA-teknologi til rumlige proteomics-assays kan bruges til visualiseringsprotokoller på en automatiseret platform, hvilket resulterer i et mere målrettet og standardiseret assay. Derudover muliggør TSA-baserede assays brugen af markører med lavt udtryk, hvilket øger rækkevidden af mål, der kan vælges til visualisering. Et 3-plex assay for panCK, FAP og Antibody X blev udviklet ved hjælp af en automatiseret platform, hvor panCK og FAP blev brugt til at skelne mellem henholdsvis tumor og stroma. Antistof X er et stromalt protein, der ofte forekommer i tumorer, men dets biologi og indvirkning på antitumorimmunitet forstås ikke fuldt ud. Karakterisering af immunkonteksten i områder, der er rige på antistof X, kan belyse dets rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons samt dets potentiale som lægemiddelmål.
Mens tilpassede automatiserede TSA-visualiseringspaneler viste sig at være vellykkede for rumlige proteomics-assays, kunne anvendelsen af disse assays til rumlige transkriptomics-assays ikke bekræftes. Dette skyldes sandsynligvis reagenserne og protokollen, der anvendes til de automatiserede visualiseringsprotokoller, som synes at kompromittere RNA-integriteten. At erkende, at en automatiseret mærkningsprotokol til visualiseringsmarkører kan bruges til rumlige proteomics-assays, men ikke til rumlige transkriptomics-assays, giver vigtig vejledning om Spatial Omics-teknologianalysedesign.
Derudover viser undersøgelsen, at det rumlige transkriptomiske assay kan bruges til at profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter eller ca. 15 celler. To ROI’er i forskellige størrelser blev udvalgt for at teste analysens evne til også at detektere transkripter i små ROI’er. For hver region af interesse blev oligoer svarende til 1.800 mRNA-mål indsamlet og lavet til biblioteker i henhold til den rumlige profileringsplatformsprotokol. Biblioteker blev individuelt indekseret, efterfølgende samlet og sekventeret. Dette gjorde det muligt at evaluere både poolingeffektivitet og evnen til at identificere specifikke cellepopulationer i små ROI’er.
Dette papir viser, at for rumlige proteomics-assays kan en automatiseret protokol til vejledning af ROI-udvælgelse på specifikke markører af interesse bruges til selektivt at målrette forhør af relevante vævsområder og karakterisere vævets rumlige miljø. Desuden demonstrerer vi, at mindre ROI’er kan bruges til rumlige transkriptomiske assays til at detektere og karakterisere specifikke cellepopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til dato anvendes direkte konjugerede fluorescerende antistoffer i en manuel protokol mest som visualiseringspaneler til rumlig proteomics eller spatial transcriptomics assays 9,10. Brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer kan dog være udfordrende for mindre rigelige markører, hvilket begrænser udvælgelsen af egnede antistoffer. Denne protokol viser, at mærkning af visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatiseret farvningsplatfo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Thomas Wu for behandling af NGS-filer. Vi takker James Ziai for resultaterne, diskussionerne og manuskriptgennemgangen og Meredith Triplet og Rachel Taylor for intern manuskriptrevision.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Referências
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
