Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas
Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).
Abstract
Las funciones potenciales de las células similares a hepatocitos (HLCs) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son muy prometedoras para el modelado de enfermedades y las aplicaciones de detección de fármacos. Aquí se proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. El establecimiento de un linaje de endodermo es un paso clave en la diferenciación a hlcs. Por nuestro método, regulamos las vías de señalización clave mediante la suplementación continua de Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación de hESC en endodermo definitivo (DE), seguido de la generación de células progenitoras hepáticas, y finalmente HLCs con morfología de hepatocitos típicos en un método stagewise con reactivos completamente definidos. Los HLCs derivados de hESC producidos por este método expresan marcadores específicos de la etapa (incluyendo albúmina, receptor nuclear HNF4α y polipéptido cotransportante de taurocolato de sodio (NTCP)), y muestran características especiales relacionadas con hepatocitos maduros y funcionales (incluyendo tinción verde de indocianina, almacenamiento de glucógeno, tinción de hematoxilina-eosina y actividad cyp3), y pueden proporcionar una plataforma para el desarrollo de aplicaciones basadas en HLC en el estudio de enfermedades hepáticas.
Introduction
El hígado es un órgano altamente metabólico que desempeña varias funciones, incluyendo la desoxidación, el almacenamiento de glucógeno, y la secreción y síntesis de proteínas1. Diversos patógenos, fármacos y herencia pueden causar cambios patológicos en el hígado y afectar sus funciones2,3. Los hepatocitos, como la unidad funcional principal del hígado, desempeñan un papel importante en sistemas artificiales de la ayuda del hígado y la eliminación de la toxicidad de la droga. Sin embargo, el recurso de hepatocitos humanos primarios es limitado en terapia basada en células, así como en la investigación de la enfermedad del higado. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas fuentes de hepatocitos humanos funcionales es una dirección de investigación importante en el campo de la medicina regenerativa. Desde 1998, cuando se han establecido las hESC4,las hESCs han sido ampliamente consideradas por los investigadores debido a su potencial de diferenciación superior (pueden diferenciarse en varios tejidos en un ambiente adecuado) y su alto grado de autorrerenovabilidad, y por lo tanto proporcionan células fuente ideales para hígados bioartificiales, trasplante de hepatocitos e incluso ingeniería de tejido hepático5.
Actualmente, la eficiencia de la diferenciación hepática puede incrementarse en gran medida enriqueciendo el endodermo6. En la diferenciación del linaje de las células madre en endodermo, los niveles del factor de crecimiento transformador β (TGF-β) señalización y WNT vías de señalización son los factores clave en el nodo de la etapa de formación de endodermo. La activación de un alto nivel de señalización de TGF-β y WNT puede promover el desarrollo de endodermo7,8. La activina A es una citoquina perteneciente a la superfamilia TGF-β. Por lo tanto, la activina A es ampliamente utilizada en la inducción de endodermo de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y hESCs9,10. GSK3 es una proteína quinasa de serina-treonina. Los investigadores han encontrado que CHIR99021, un inhibidor específico de GSK3β, puede estimular las señales típicas de WNT, y puede promover la diferenciación de células madre bajo ciertas condiciones, lo que sugiere que CHIR99021 tiene potencial para inducir la diferenciación de células madre en endodermo 11,12,13.
Aquí divulgamos un método eficiente y reproducible para inducir con eficacia la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. La adición secuencial de Activin A y CHIR99021 produjo cerca de 89,7±0,8% SOX17 (marcador de DE) – células positivas. Después de ser maduradas más a fondo in vitro,estas células expresaron marcadores específicos hepáticos y ejercieron hepatocito-como la morfología (basada en la coloración de la hematoxylin-eosina (H . E)) y las funciones, tales como absorción del verde del indocyanine (ICG), almacenamiento del glicógeno y actividad CYP3. Los resultados muestran que los hESCs se pueden distinguir con éxito en HLCs funcionales maduros por este método y pueden proporcionar una base para la investigación enfermedad-relacionada del higado y la investigación in vitro de la droga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un método gradual que induce HLCs de hESCs en tres etapas. En la primera etapa, Activin A y CHIR99021 se utilizaron para diferenciar hESCs en DE. En la segunda etapa, KO-DMEM y DMSO fueron utilizados para distinguir DE en las células hepáticas del progenitor. En la tercera etapa, HZM más HGF, OSM y la sal de sodio del hemisuccinate 21 de la hidrocortisona fueron utilizados para continuar diferenciando las células hepáticas del progenitor en HLCs.
Los siguientes pasos c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81870432 y 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 a P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 a P.N.S.). Nos gustaría agradecer al Prof. Stanley Lin de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou por sus útiles consejos.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
Referências
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