Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).
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Artigo de método
Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cilia primária (PC) são organelas dinâmicas de microtúbulos não motil que se projetam da superfície da maioria das células mamíferas. Eles emergem do centríclulo mais antigo durante a fase G1/G0 do ciclo celular, enquanto desmontam à medida que as células reentram no ciclo celular no limite da fase G2/M. Eles funcionam como hubs de sinal, detectando e transduzindo sinais extracelulares cruciais para muitos processos celulares. Semelhante à maioria dos tipos de células, todas as células-tronco neurais neocorticais e progenitoras (NSPCs) têm sido mostradas abrigando um PC permitindo-lhes sentir e transduzir sinais específicos necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para gerar e caracterizar modelos bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) baseados em células-tronco de células-tronco induzidas por humanos (hIPSCs) para dissecar ainda mais o envolvimento do PC durante o desenvolvimento neocortical. Em particular, apresentamos protocolos para estudar a biogênese do PC e funcionar em NSPCs derivados de roseta neural 2D, incluindo a transdução da via Sonic Hedgehog (SHH). Para aproveitar a organização tridimensional (3D) de organoides cerebrais, descrevemos um método simples para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos. Após a limpeza óptica, a rápida aquisição de organoides inteiros permite a detecção de centrossomos e PC em progenitores neocorticais e neurônios de todo o organoide. Por fim, detalhamos o procedimento de imunostenção e compensação de seções organoides de flutuação livre espessa preservando um grau significativo de informações espaciais 3D e permitindo a aquisição de alta resolução necessária para a análise qualitativa e quantitativa detalhada da biogênese e função do PC.
Introdução
Cílios primários (PC) são organelas à base de microtúbulos que sentem e transduzem uma infinidade de pistas químicas e mecânicas do ambiente extracelular. Em particular, pc é a organela central para a transdução da via de sinalização hedgehog em vertebrados1,2. Embora a maioria das células neurais tenham sido mostradas há muito tempo abrigando um PC, a contribuição desta organela na formação do sistema nervoso central tem sido há muito desvalorizada. Estudos sobre desenvolvimento neocortical levaram à descoberta de múltiplas células-tronco neurais e progenitoras (NSPCs), todas abrigando um PC, local que foi pr....
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Protocolo
1. Geração de modelos baseados em células 2D hIPS de desenvolvimento neocortical
- Formação de roseta neural
- Comece com as culturas do HIPSC abrigando grandes colônias regulares, exibindo menos de 10% de diferenciação e não mais de 80% de confluência.
- Enxágüe os hIPSCs com 2 mL de PBS.
- Adicione 2 mL de meio de indução NSPC complementado com o inibidor de rocha (NIM + 10 μM de Y-27632).
- Dissecar manualmente cada colônia hIPSC de um prato de 35 mm usando uma agulha para cortar cada colônia precisamente em direções horizontais e verticais para criar um padrão de tabuleiro de verificador ....
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Resultados
Modelos baseados em células 2D hIPS para estudar biogênese e função do círio primário
O protocolo aqui detalhado foi adaptado de estudos publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite a geração de estruturas de roseta neural que contêm progenitores neocorticais e neurônios semelhantes aos vistos no neocórtex em desenvolvimento. A validação detalhada pode ser realizada por meio de análises convencion.......
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Discussão
O PC é agora considerado como organelas-chave que regulam etapas cruciais durante o desenvolvimento cortical cerebral normal18,19,31, incluindo a expansão e o compromisso do NSPC 8,9,10,11,12, bem como migração neuronal13,14
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subvenções da Agence Nationale de la Recherche (ANR) para S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). A LB é apoiada pelo programa AnR under Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) e pelo Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). O Instituto Imagine é apoiado pelo financiamento estatal da ANR no âmbito do programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, projetos CrossLab) e como parte do segundo programa Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoé thanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Placas de múltiplos poços | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), menos vitamina A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), sem soro | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Tampão de Diluição | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µ g | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2, 25µ g | Thermofischer | PHG0264 | |
| Reagente de Dissociação Celular Suave | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulina | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminina (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Fator de Crescimento Reduzido | Corning | 354230 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Agitador orbital | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Microscopia Eletrônica Ciências | 15714 | |
| Poli-L-Ornitina (PO) | Sigma | P4957 | |
| BDNF humano recombinante 10 µ g | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Humano Recombinante FGF-básico | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R& D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Lâminas de Adesão | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supple agudo; mento N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2'-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectina | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Anticorpos Primários | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R& D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Caderina | BD Transdução | Lab 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R& D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γ TUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500E |
| Caprino anti-rato AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
Referências
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. ....
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Reimpressões e permissões
