Vi presenterer detaljerte protokoller for generering og karakterisering av 2D og 3D human indusert pluripotent stamcelle (hIPSC)-baserte modeller for neokortisk utvikling samt komplementære metoder som muliggjør kvalitativ og kvantitativ analyse av primær cilium (PC) biogenese og funksjon.
Primær cilia (PC) er ikke-motile dynamiske mikrotubulebaserte organeller som stikker ut fra overflaten av de fleste pattedyrceller. De kommer ut av den eldre sentriolen under G1/G0-fasen av cellesyklusen, mens de demonteres når cellene går inn i cellesyklusen ved G2/M-fasegrensen igjen. De fungerer som signalhuber, ved å oppdage og transdusere ekstracellulære signaler som er avgjørende for mange celleprosesser. I likhet med de fleste celletyper har alle neokortiske nevrale stamme- og stamceller (NSPCer) vist seg å ha en PC som gjør at de kan føle og transdusere spesifikke signaler som kreves for den normale cerebral kortikale utviklingen. Her tilbyr vi detaljerte protokoller for å generere og karakterisere todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) cellebaserte modeller fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) for å ytterligere dissekere involvering av PC under neokortisk utvikling. Spesielt presenterer vi protokoller for å studere PC-biogenesen og funksjonen i 2D nevrale rosett-avledede NSPCer, inkludert transduksjon av Sonic Hedgehog (SHH) -banen. For å dra nytte av den tredimensjonale (3D) organiseringen av cerebral organoider, beskriver vi en enkel metode for 3D-avbildning av i toto immunosterte cerebral organoider. Etter optisk rydding tillater rask oppkjøp av hele organoider påvisning av både sentrosomer og PC på neokortiske forfedre og nevroner i hele organoiden. Til slutt beskriver vi prosedyren for immunstaining og rydding av tykke frittflytende organoide seksjoner som bevarer en betydelig grad av 3D-romlig informasjon og tillater høyoppløselig oppkjøp som kreves for detaljert kvalitativ og kvantitativ analyse av PC-biogenese og funksjon.
Primær cilia (PC) er mikrotubule-baserte organeller som sanser og transduserer en mengde kjemiske og mekaniske signaler fra det ekstracellulære miljøet. Spesielt er PC den sentrale organellen for transduksjon av Hedgehog-signalveien i vertebrater1,2. Mens de fleste nevrale celler lenge har blitt vist å huse en PC, har bidraget fra denne organellen i å forme sentralnervesystemet lenge vært undervurdert. Studier på neokortisk utvikling har ført til oppdagelsen av flere nevrale stamme- og stamceller (NSPCer), som alle har en PC, hvorav plasseringen er foreslått å være avgjørende for forfederens skjebnebestemmelse3,4,5,6,7. PC har vist seg avgjørende for cellemekanismer som kreves for normal cerebral kortikale utvikling, inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet av radial glial stillas som støtter nevronal migrasjon13. I tillegg kreves PC under interneurons tangentielle migrasjon til kortikale plate14,15. Til slutt har det blitt foreslått en rolle for PCen i etableringen av synaptiske forbindelser av nevroner i hjernebarken16,17. Til sammen argumenterer disse funnene for en avgjørende rolle for PC på store trinn i cerebral kortikale utvikling18,19 og øker behovet for å undersøke deres engasjement i de patologiske mekanismene som ligger til grunn for anomalier av cerebral kortikale utvikling.
Nyere studier har i stor grad forbedret vår forståelse av viktige cellulære og molekylære forskjeller mellom kortikale utvikling i menneskelige og dyremodeller, med vekt på behovet for å utvikle menneskelige modellsystemer. I dette synet representerer menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) en lovende tilnærming til å studere sykdomspatogenese i en relevant genetisk og cellulær kontekst. Tilhenger todimensjonale (2D) cellebaserte modeller eller nevrale rosetter inneholder NSPCer som ligner de som er sett i den utviklende hjernebarken, som blir organisert i rosettformede strukturer som viser riktig apicobasal polaritet20,21,22. Videre tillater det tredimensjonale (3D) kultursystemet generering av dorsale forebrain organoider som rekapitulerer mange trekk ved menneskelig cerebral kortikale utvikling23,24,25,26. Disse to komplementære cellebaserte modelleringsmetodene gir spennende perspektiver for å dissekere involvering av PC under normal og patologisk utvikling av hjernebarken.
Her tilbyr vi detaljerte protokoller for generering og karakterisering av nevrale rosetter og avledede NSPCer samt dorsale forebrain organoider. Vi tilbyr også detaljerte protokoller for å analysere biogenesen og funksjonen til PC som er tilstede på NSPCer ved å teste transduksjonen av Sonic Hedgehog-banen og analysere dynamikken til viktige molekyler involvert i denne veien. For å dra nytte av 3D-organiseringen av cerebral organoider, setter vi også opp en enkel og kostnadseffektiv metode for 3D-avbildning av in toto immunosterte cerebral organoider som tillater rask oppkjøp, takket være et lysarkmikroskop, av hele organoiden, med høy oppløsning som gjør det mulig å visualisere PC på alle typer neokortiske forfedre og nevroner av hele organoidet. Til slutt tilpasset vi immunhiistokjemi på 150 μm frittflytende seksjoner med etterfølgende rydding og oppkjøp ved hjelp av resonansskanning konfektmikroskop som tillater høyoppløselig bildeanskaffelse, som kreves for detaljert analyse av PC-biogenese og funksjon. Spesielt tillater 3D-bildebehandlingsprogramvare 3D-rekonstruksjon av PC med etterfølgende analyse av morfologiske parametere, inkludert lengde, antall og orientering av PC, samt signalintensitetsmåling av ciliary komponenter langs axoneme.
PC er nå ansett som viktige organeller som regulerer viktige skritt under normal cerebral kortikale utvikling18,19,31 inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt nevronal migrasjon13,14 og synapt…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (ANR) til S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) og N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 og ANR-19-CE16-0002-01). LB støttes av ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) og Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programmet). Imagine Institute støttes av statlig finansiering fra ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-prosjekter) og som en del av det andre Investissements d’Avenir-programmet (ANR-17-RHUS-0002).
2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
DMSO | ATCC | 4-X | |
Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
Primary Antibodies | |||
ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |