تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل
Summary
يظهر هنا بروتوكول لنهج تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) القائم على الرحلان الكهربائي الشعري إلى جانب قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. يميز هذا النهج الفرق في الهياكل ذات الترتيب الأعلى بين أنواع البروتين المختلفة ، بما في ذلك البروتينات في حالات مختلفة وأشكال بروتينية مختلفة ، من خلال إجراء فصل HDX التفاضلي المتزامن والفصل الكهربائي.
Abstract
لا يزال حل عدم التجانس التوافقي لحالات البروتين المتعددة التي تتعايش في المحلول أحد العقبات الرئيسية في توصيف علاجات البروتين وتحديد مسارات الانتقال التوافقية الحاسمة للوظائف البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الإنزيمي. يوفر تفاعل تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) إلى جانب التحليل الطيفي الكتلي من أعلى إلى أسفل (MS) وسيلة لتوصيف هياكل وديناميكيات البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة مطابقة محددة. تعتمد قوة الحل التوافقية لهذه التقنية بشكل كبير على كفاءة فصل حالات البروتين على مستوى البروتين السليم وتقليل المحتوى البروتيكي المتبقي غير المثني أثناء تفاعلات HDX.
هنا نصف متغيرا قائما على الرحلان الكهربائي الشعري (CE) لنهج HDX MS الذي يهدف إلى تحسين الدقة المطابقة. في هذا النهج ، تخضع البروتينات لتفاعلات HDX أثناء الهجرة عبر محلول إلكتروليت الخلفية المحايد (BGE) أثناء الفصل الكهربائي الشعري. يمكن فصل حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تتعايش في المحلول بكفاءة بناء على نسب الشحن إلى الحجم المختلفة. الفرق في الحركة الكهربية بين البروتينات وجزيئات المذيبات البروتيكية يقلل من المذيب المتبقي غير المخصي ، مما يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا أثناء عملية HDX. تسمح واجهة CE-MS المتدفقة عبر الميكروفيال بالتأين الكهربائي الفعال لأنواع البروتين المنتفخة بعد الخلط السريع مع محلول معدل التبريد وتغيير الطبيعة عند مخرج البخاخ. يقيس تحليل التصلب المتعدد عبر الإنترنت من أعلى إلى أسفل مستوى التثدي العالمي لأنواع البروتين السليمة التي تم التخلص منها ، وبالتالي إزالة خصاء شظاياها في الطور الغازي. توضح هذه الورقة هذا النهج في HDX التفاضلي للأنظمة ، بما في ذلك متغيرات البروتين الطبيعي التي تتعايش في الحليب.
Introduction
إن التمييز بين أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل وتوصيف اختلافاتها الهيكلية أمر مهم لرصد مسارات التحولات بين هذه الأنواع المشاركة في الأحداث البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الأنزيمي ، وفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث. لا توفر التقنيات الفيزيائية الحيوية التقليدية حلا كاملا بسبب القيود مثل عدم كفاية الدقة وفقدان المعلومات الديناميكية في الحل. تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم إلى جانب قياس الطيف الكتلي (HDX MS) هو تقنية تصف السمات الهيكلية والتوافقية للبروتينات مع الديوتيريوم (2 H) عن طريق التبادل بين ذرات الهيدروجين الشفوية للبروتينات و 2 H من محلول 2 H 2O الذي تمإدخاله عمدا. البروتونات المشاركة في الترابط الهيدروجيني أو التي يتم عزلها عن المذيب في داخل البروتين لا تتبادل بسهولة1. وبالتالي ، نظرا لأن سعر الصرف في موقع قابل للتبادل يعتمد بشكل كبير على مشاركته في هياكل أعلى ترتيبا ، يمكن الكشف عن هياكل البروتين بدقة مكانية عالية بواسطة MS الذي يسبر مدى ومعدل امتصاص 2 H بناء على الكتل الذرية المختلفة بين 1H و 2H. على مدى العقود الأخيرة ، أصبح HDX MS تقنية ناجحة بشكل رائع لدراسة تشكيلات البروتين وديناميكياته2.
في النهج الكلاسيكي من أسفل إلى أعلى ل HDX MS ، يتم بروتينية مجموعة أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل دون فصل على مستوى البروتين السليم ، مما يجعل من غير الممكن توصيف الأنواع الفردية من خلال تحليل شظايا التحلل البروتيني الناتجة مع محتويات الديوتيريوم المعقدة. في المقابل، في النهج من أعلى إلى أسفل، تؤدي حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تضمنت محتويات مختلفة من الديوتيريوم إلى توزيعات متعددة لكتل البروتين السليمة في فحص التصلب المتعدد. وهذا يسمح بفصل الأنواع الفردية عن طريق اختيار كتلة الأيونات المقابلة لكل توزيع كتلي باستخدام مرشح كتلة مناسب (مثل رباعي) وتوصيف اختلافاتها التوافقية في تحليل MS الترادفي اللاحق 3,4,5,6. ومع ذلك ، فإن كفاءة فصل حالات البروتين أو البروتيوفورمات في هذه الاستراتيجية محدودة بمدى الاختلاف في توزيعات الكتلة المقابلة لها.
يوفر الرحلان الكهربائي الشعري (CE) وسيلة لفصل أنواع البروتين بناء على شحناتها المختلفة وأحجامها الهيدروديناميكية في مرحلة الحل بكفاءة عالية7. الجمع بين CE و HDX يوفر فصلا إضافيا لحالات البروتين أو البروتيوفورمات في مرحلة الحل. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الحجم الصغير للشعيرات الدموية CE باستخدام محلول متحلل بالكامل كمحلول إلكتروليت في الخلفية (BGE) ، أي المخزن المؤقت الجاري ، مما يجعل الشعيرات الدموية كمفاعل HDX لعينات البروتين. نظرا للاختلاف في التنقل الكهربائي بين البروتينات والكواشف البروتيكية في عملية الرحلان الكهربائي ، فإن إجراء HDX خلال CE يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا لتحليلات البروتين مع الحد الأدنى من المحتويات المتبقية غير المثنية ، وبالتالي تعزيز حساسية التحليل الهيكلي باستخدام بيانات HDX. على هذا النحو ، قمنا بتطوير نهج HDX التفاضلي القائم على CE إلى جانب MS من أعلى إلى أسفل لتوصيف هياكل البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة خاصة بالحالة أو البروتيوفورم8.
تصف هذه الورقة بروتوكولات هذا النهج من خلال تفصيل خطوات إعداد المواد والإجراءات التجريبية وتحليل البيانات. يتم سرد العوامل التي قد تؤثر على أداء الطريقة أو جودة البيانات في ملاحظات قصيرة. تشمل النتائج التمثيلية المعروضة هنا بيانات HDX التفاضلية لمخاليط البروتينات المختلفة والمتغيرات الطبيعية للبلورة البقرية β-lactoglobulin (β-lg) ، وهو بروتين مصل اللبن الرئيسي الموجود في الحليب9. نحن نظهر كفاءة الفصل ، وقابلية التكرار ، وأداء وضع العلامات H 2للمتغيرين الوفيرين من β-lg ، أي A و B10,11 خلال HDX القائم على CE والتوصيف الخاص بالمتغيرات لتشكيلاتهما.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشمل أهداف طلاء الجدار الداخلي للشعيرات الدموية CE تقليل التدفق الكهرواسمي وامتصاص البروتين أثناء عملية CE13. على الرغم من أن التدفق الكهرواسموزي مفيد لتحليل CE التقليدي للجزيئات الصغيرة بسبب قدرته على دفع الأنواع المحايدة أو المشحونة بشكل معاكس إلى الكاشف ، إلا أنه يعرض للخطر …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 21974069). وتلقى المؤلفون أيضا دعما من معهد تحليل الخلايا، مختبر خليج شنتشن، الصين؛ مركز جيانغسو للابتكار التعاوني للمواد الوظيفية الطبية الحيوية ؛ ومختبر جيانغسو الرئيسي للمواد الطبية الحيوية في جامعة نانجينغ نورمال ، الصين.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
Referências
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Bioquímica. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Bioquímica. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
