Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri
Summary
Præsenteret her er en protokol for en kapillær elektroforesebaseret hydrogen / deuterium udveksling (HDX) tilgang kombineret med top-down massespektrometri. Denne tilgang karakteriserer forskellen i højere ordens strukturer mellem forskellige proteinarter, herunder proteiner i forskellige tilstande og forskellige proteoformer, ved at udføre samtidig differentiel HDX og elektroforetisk adskillelse.
Abstract
Løsning af konformationel heterogenitet af flere proteintilstande, der sameksisterer i opløsning, forbliver en af de største hindringer i karakteriseringen af proteinterapi og bestemmelsen af de konformationelle overgangsveje, der er kritiske for biologiske funktioner, lige fra molekylær anerkendelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium udveksling (HDX) reaktion kombineret med top-down massespektrometrisk (MS) analyse giver et middel til at karakterisere protein højere ordens strukturer og dynamik på en konformator-specifik måde. Den konformationelle opløsningskraft af denne teknik er stærkt afhængig af effektiviteten af at adskille proteintilstande på det intakte proteinniveau og minimere det resterende ikke-deutererede protiske indhold under HDX-reaktionerne.
Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-baseret variant af HDX MS-tilgangen, der sigter mod at forbedre konformationsopløsningen. I denne tilgang gennemgår proteiner HDX-reaktioner, mens de migrerer gennem en deuteret baggrundselektrolytopløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk adskillelse. Forskellige proteintilstande eller proteoformer, der sameksisterer i opløsning, kan adskilles effektivt baseret på deres forskellige ladnings-til-størrelsesforhold. Forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske opløsningsmiddelmolekyler minimerer det resterende ikke-deutererede opløsningsmiddel, hvilket resulterer i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø under HDX-processen. Den gennemstrømningsmikroviale CE-MS-grænseflade muliggør effektiv elektrosprayionisering af de eluerede proteinarter efter en hurtig blanding med sluknings- og denatureringsmodifikatoropløsningen ved sprøjtens udløb. Online top-down MS-analysen måler det globale deuterationsniveau for de eluerede intakte proteinarter og efterfølgende deuterationen af deres gasfasefragmenter. Dette papir demonstrerer denne tilgang i differentiel HDX for systemer, herunder de naturlige proteinvarianter, der eksisterer sammen i mælk.
Introduction
At skelne proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande og karakterisere deres strukturelle forskelle er vigtige for at overvåge overgangsvejene mellem disse arter, der er involveret i biologiske begivenheder, lige fra molekylær genkendelse til enzymatisk katalyse og forstå de mekanismer, der ligger til grund for disse begivenheder. Konventionelle biofysiske teknikker giver ikke en komplet løsning på grund af begrænsningerne såsom utilstrækkelig opløsning og tab af dynamisk information i løsningen. Hydrogen/deuteriumudveksling kombineret med massespektrometri (HDX MS) er en teknik, der mærker de strukturelle og konformationelle træk ved proteiner med deuterium (2H) via udvekslingen mellem labile hydrogenatomer af proteiner og 2H fra den bevidst indførte2H20-opløsning. Protoner, der er involveret i hydrogenbinding, eller som er sekvestreret fra opløsningsmidlet i proteininteriøret, udveksler ikke let1. Da valutakursen på et udskifteligt sted således er stærkt afhængig af dens involvering i højere ordens strukturer, kan proteinstrukturerne afsløres ved høj rumlig opløsning af MS, der undersøger omfanget og hastigheden af 2H-optagelse baseret på de forskellige atommasser mellem 1H og 2H. I løbet af de seneste årtier er HDX MS blevet en enestående succesfuld teknik til at studere proteinkonformationer og dynamik2.
I den klassiske bottom-up-tilgang til HDX MS proteolyseres ensemblet af proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande uden adskillelse på det intakte proteinniveau, hvilket gør det umuligt at karakterisere individuelle arter ved at analysere de resulterende proteolytiske fragmenter med indviklet deuteriumindhold. I modsætning hertil giver forskellige proteintilstande eller proteoformer, der har inkorporeret forskellige deuteriumindhold, i top-down-tilgangen anledning til flere fordelinger af intakte proteinmasser i en MS-scanning. Dette gør det muligt at adskille individuelle arter ved masseudvælgelse af ioner svarende til hver massefordeling ved hjælp af et korrekt massefilter (såsom en quadrupol) og karakteriseringen af deres konformationsforskelle i den efterfølgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. Effektiviteten af at adskille proteintilstande eller proteoformer i denne strategi er imidlertid begrænset af omfanget af forskellen i deres tilsvarende massefordelinger.
Kapillærelektroforese (CE) giver et middel til at adskille proteinarter baseret på deres forskellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i opløsningsfasen med høj effektivitet7. Kombination af CE med HDX giver yderligere adskillelse af proteintilstande eller proteoformer i opløsningsfasen. Derudover tillader det lille volumen af CE-kapillæren udnyttelse af en fuldt deuteret opløsning som baggrundselektrolytopløsningen (BGE), dvs. den løbende buffer, hvilket gør kapillæren til en HDX-reaktor til proteinprøver. På grund af forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprocessen resulterer udførelse af HDX under CE i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø for proteinanalytterne med minimalt resterende ikke-deuteret indhold, hvilket øger følsomheden af strukturanalysen ved hjælp af HDX-data. Som sådan udviklede vi en CE-baseret differentiel HDX-tilgang kombineret med top-down MS til at karakterisere protein højere ordens strukturer på en tilstands- eller proteoform-specifik måde8.
Dette papir beskriver protokoller for denne tilgang ved at beskrive trinene i materialeforberedelse, eksperimentel procedure og dataanalyse. Faktorer, der kan påvirke metodens ydeevne eller datakvalitet, er angivet i korte noter. De repræsentative resultater, der præsenteres her, omfatter differentielle HDX-data for blandinger af forskellige proteiner og naturlige varianter af kvæg β-lactoglobulin (β-lg), det vigtigste valleprotein, der findes i mælk9. Vi demonstrerer separationseffektivitet, reproducerbarhed og 2H-mærkningsydelse for de to rigelige varianter af β-lg, dvs. A og B10,11 under den CE-baserede HDX og variantspecifik karakterisering af deres konformationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med at belægge CE-kapillærens indre væg omfatter minimering af den elektroosmotiske strøm og proteinabsorption under CE-processen13. Selvom elektroosmotisk strømning er gavnlig for konventionel CE-analyse af små molekyler på grund af dens evne til at køre neutrale eller modsat ladede arter til detektoren, kompromitterer det separationseffektiviteten af proteinarter med lignende størrelser og nettoladninger i opløsning. Belægning af kapillæren med HPC minimerer den elektroosmo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne modtog også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center for Biomedicinske Funktionelle Materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
Referências
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Bioquímica. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Bioquímica. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
