Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie
Summary
Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.
Abstract
Die Auflösung der Konformationsheterogenität mehrerer Proteinzustände, die in Lösung koexistieren, bleibt eines der Haupthindernisse bei der Charakterisierung von Proteintherapeutika und der Bestimmung der für biologische Funktionen kritischen Konformationsübergangswege, die von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse reichen. Die Reaktion auf Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX) in Verbindung mit der top-down-Massenspektrometrie (MS) bietet ein Mittel, um Proteinstrukturen und -dynamiken höherer Ordnung konformitätsspezifisch zu charakterisieren. Das Konformationsauflösungsvermögen dieser Technik hängt stark von den Wirkungsgraden der Trennung von Proteinzuständen auf intakter Proteinebene und der Minimierung des verbleibenden nicht deuterierten Protikgehalts während der HDX-Reaktionen ab.
Hier beschreiben wir eine auf Kapillarelektrophorese (CE) basierende Variante des HDX MS-Ansatzes, die darauf abzielt, die Konformationsauflösung zu verbessern. Bei diesem Ansatz durchlaufen Proteine HDX-Reaktionen, während sie während der kapillaren elektrophoretischen Trennung durch eine deuterierte Hintergrundelektrolytlösung (BGE) wandern. Verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die in Lösung koexistieren, können aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungs-zu-Größe-Verhältnisse effizient getrennt werden. Der Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Lösungsmittelmolekülen minimiert das verbleibende nicht deuterierte Lösungsmittel, was zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung während des HDX-Prozesses führt. Die durchströmende mikroviale CE-MS-Grenzfläche ermöglicht eine effiziente Elektrosprayionisation der eluierten Proteinspezies nach einer schnellen Vermischung mit der Abschreck- und Denaturierungsmodifikatorlösung am Ausgang des Sprühgeräts. Die Online-Top-Down-MS-Analyse misst das globale Deuterationsniveau der eluierten intakten Proteinspezies und anschließend die Deuteration ihrer Gasphasenfragmente. Dieses Papier demonstriert diesen Ansatz in differentiellem HDX für Systeme, einschließlich der natürlichen Proteinvarianten, die in Milch koexistieren.
Introduction
Die Unterscheidung von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen und die Charakterisierung ihrer strukturellen Unterschiede sind wichtig, um die Wege der Übergänge zwischen diesen Spezies zu überwachen, die an biologischen Ereignissen beteiligt sind, von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse, und um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Ereignissen zugrunde liegen. Herkömmliche biophysikalische Techniken bieten aufgrund der Einschränkungen wie unzureichende Auflösung und Verlust dynamischer Informationen in der Lösung keine vollständige Lösung. Der Wasserstoff/Deuterium-Austausch in Verbindung mit der Massenspektrometrie (HDX MS) ist eine Technik, die die Struktur- und Konformationsmerkmale von Proteinen mit Deuterium (2 H) über den Austausch zwischen labilen Wasserstoffatomen von Proteinen und 2 H aus der absichtlich eingeführten 2H2O-Lösung markiert. Protonen, die an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind oder die aus dem Lösungsmittel im Proteininneren sequestriert werden, tauschen nicht leicht1 aus. Da die Wechselkursrate an einem austauschbaren Ort stark von seiner Beteiligung an Strukturen höherer Ordnung abhängt, können die Proteinstrukturen mit hoher räumlicher Auflösung von MS aufgedeckt werden, die das Ausmaß und die Rate der 2-H-Aufnahme basierend auf den unterschiedlichen Atommassen zwischen 1H und 2H untersucht. HDX MS hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer herausragend erfolgreichen Technik zur Untersuchung von Proteinkonformationen und -dynamikenentwickelt 2.
Beim klassischen Bottom-up-Ansatz von HDX MS wird das Ensemble von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen ohne Trennung auf intakter Proteinebene proteolysiert, so dass es nicht möglich ist, einzelne Spezies durch Analyse der resultierenden proteolytischen Fragmente mit konvolutem Deuteriumgehalt zu charakterisieren. Im Gegensatz dazu führen beim Top-Down-Ansatz verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die unterschiedliche Deuteriumgehalte eingebaut haben, zu einer Mehrfachverteilung intakter Proteinmassen in einem MS-Scan. Dies ermöglicht die Trennung einzelner Spezies durch Massenselektion von Ionen entsprechend jeder Massenverteilung unter Verwendung eines geeigneten Massenfilters (z. B. eines Quadrupols) und die Charakterisierung ihrer Konformationsunterschiede in der anschließenden Tandem-MS-Analyse 3,4,5,6. Die Effizienz der Trennung von Proteinzuständen oder Proteoformen in dieser Strategie ist jedoch durch das Ausmaß der Differenz in ihren entsprechenden Massenverteilungen begrenzt.
Die Kapillarelektrophorese (CE) bietet die Möglichkeit, Proteinspezies basierend auf ihren unterschiedlichen Ladungen und hydrodynamischen Größen in der Lösungsphase mit hohem Wirkungsgradzu trennen 7. Die Kombination von CE mit HDX bietet eine zusätzliche Trennung von Proteinzuständen oder Proteoformen in der Lösungsphase. Darüber hinaus ermöglicht das geringe Volumen der CE-Kapillare die Verwendung einer vollständig deuterierten Lösung als Hintergrundelektrolytlösung (BGE), d. H. Der laufende Puffer, wodurch die Kapillare als HDX-Reaktor für Proteinproben dient. Aufgrund des Unterschieds in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Reagenzien im Elektrophoreseprozess führt die Durchführung von HDX während der CE zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung für die Proteinanalyten mit minimalen verbleibenden nicht deuterierten Inhalten, wodurch die Empfindlichkeit der Strukturanalyse unter Verwendung von HDX-Daten erhöht wird. Daher entwickelten wir einen CE-basierten differentiellen HDX-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-MS, um Proteinstrukturen höherer Ordnung auf zustands- oder proteoformspezifische Weise zu charakterisieren8.
Dieses Papier beschreibt Protokolle für diesen Ansatz, indem die Schritte der Materialvorbereitung, des experimentellen Verfahrens und der Datenanalyse detailliert beschrieben werden. Faktoren, die sich auf die Methodenleistung oder die Datenqualität auswirken können, sind in kurzen Anmerkungen aufgeführt. Zu den repräsentativen Ergebnissen, die hier vorgestellt werden, gehören differentielle HDX-Daten von Mischungen verschiedener Proteine und natürlichen Varianten von Rinder-β-Lactoglobulin (β-lg), dem wichtigsten Molkenprotein in Milch9. Wir demonstrieren die Trenneffizienz, Reproduzierbarkeit und 2-H-Markierungsleistung der beiden reichlich vorhandenen Varianten von β-lg, d.h. A und B10,11 während der CE-basiertenHDX und variantenspezifischen Charakterisierung ihrer Konformationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zu den Zielen der Beschichtung der Innenwand der CE-Kapillare gehören die Minimierung des elektroosmotischen Flusses und die Proteinabsorption während des CE-Prozesses13. Obwohl der elektroosmotische Fluss für die konventionelle CE-Analyse kleiner Moleküle von Vorteil ist, da er neutrale oder entgegengesetzt geladene Spezies zum Detektor treiben kann, beeinträchtigt er die Trenneffizienz von Proteinspezies mit ähnlichen Größen und Nettoladungen in Lösung. Die Beschichtung der Kapillare mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069) unterstützt. Die Autoren erhielten auch Unterstützung vom Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center für biomedizinische Funktionsmaterialien; und Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials an der Nanjing Normal University, China.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
Referências
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