Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз
Summary
Здесь представлен протокол для подхода на основе капиллярного электрофореза на основе водорода / дейтерия (HDX) в сочетании с масс-спектрометрией сверху вниз. Этот подход характеризует различие в структурах более высокого порядка между различными видами белков, включая белки в разных состояниях и различные протеоформы, путем проведения одновременного дифференциального HDX и электрофоретического разделения.
Abstract
Разрешение конформационной гетерогенности множественных белковых состояний, сосуществующих в растворе, остается одним из основных препятствий в характеристике белковой терапии и определении конформационных путей перехода, критически важных для биологических функций, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа. Реакция водородно-дейтериевого обмена (HDX) в сочетании с масс-спектрометрическим анализом сверху вниз (MS) обеспечивает средство для характеристики структур и динамики белка более высокого порядка в зависимости от конформера. Конформационная разрешающая способность этого метода в значительной степени зависит от эффективности разделения белковых состояний на уровне интактного белка и минимизации остаточного недейтерированного протического содержания во время реакций HDX.
Здесь мы описываем вариант подхода HDX MS на основе капиллярного электрофореза (CE), который направлен на улучшение конформационного разрешения. При таком подходе белки подвергаются реакциям HDX при миграции через дейтерированный раствор фонового электролита (BGE) во время капиллярного электрофоретического разделения. Различные белковые состояния или протеоформы, которые сосуществуют в растворе, могут быть эффективно разделены на основе их различного соотношения заряда к размеру. Разница в электрофоретической подвижности между белками и молекулами протического растворителя сводит к минимуму остаточный недететерированный растворитель, что приводит к почти полной дейтерирующей среде во время процесса HDX. Проточный микроволичный интерфейс CE-MS обеспечивает эффективную электрораспылительную ионизацию элюированных белковых веществ после быстрого смешивания с раствором модификатора закалки и денатурации на выходе из опрыскивателя. Онлайн-анализ РС сверху вниз измеряет глобальный уровень дейтрации элюированных интактных белковых видов и, следовательно, дейтрацию их фрагментов газовой фазы. В данной работе демонстрируется этот подход в дифференциальном HDX для систем, включая естественные варианты белка, сосуществующие в молоке.
Introduction
Различение белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях и характеристика их структурных различий важны для мониторинга путей переходов между этими видами, участвующими в биологических событиях, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа, и понимания механизмов, лежащих в основе этих событий. Обычные биофизические методы не обеспечивают полного решения из-за таких ограничений, как недостаточное разрешение и потеря динамической информации в растворе. Водородно-дейтериевый обмен в сочетании с масс-спектрометрией (HDX MS) представляет собой метод, который маркирует структурные и конформационные особенности белков дейтерием (2H) посредством обмена между лабильными атомами водорода белков и 2H из преднамеренно введенного раствора 2H2O. Протоны, участвующие в водородной связи или изолированные от растворителя внутри белка, не обмениваются легко1. Таким образом, поскольку обменный курс на обменном участке сильно зависит от его участия в структурах более высокого порядка, белковые структуры могут быть выявлены с высоким пространственным разрешением MS, который исследует степень и скорость поглощения 2H на основе различных атомных масс между 1H и 2H. За последние десятилетия HDX MS стал чрезвычайно успешным методом изучения конформаций и динамики белка2.
В классическом восходящем подходе HDX MS ансамбль белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях протеолизируется без разделения на интактном белковом уровне, что делает невозможным характеристику отдельных видов путем анализа полученных протеолитических фрагментов с запутанным содержанием дейтерия. Напротив, в нисходящем подходе различные белковые состояния или протеоформы, которые включали различное содержание дейтерия, приводят к множественному распределению неповрежденных белковых масс при сканировании РС. Это позволяет отдельным видам быть разделенными путем массового отбора ионов, соответствующих каждому распределению массы, с использованием надлежащего массового фильтра (такого как квадруполь) и характеристики их конформационных различий в последующем тандемном анализе МС 3,4,5,6. Однако эффективность разделения белковых состояний или протеоформ в этой стратегии ограничена степенью разницы в их соответствующих массовых распределениях.
Капиллярный электрофорез (СЕ) обеспечивает средство для разделения белковых видов на основе их различных зарядов и гидродинамических размеров в фазе раствора с высокой эффективностью7. Сочетание CE с HDX обеспечивает дополнительное разделение белковых состояний или протеоформ в фазе раствора. Кроме того, небольшой объем капилляра CE позволяет использовать полностью дейтерированный раствор в качестве фонового раствора электролита (BGE), т. е. работающего буфера, превращая капилляр в реактор HDX для образцов белка. Из-за разницы в электрофоретической подвижности между белками и протическими реагентами в процессе электрофореза, проведение HDX во время CE приводит к почти полной дейтерирующей среде для белковых аналитов с минимальным остаточным недететерированным содержимым, тем самым повышая чувствительность структурного анализа с использованием данных HDX. Таким образом, мы разработали дифференциальный подход HDX на основе CE в сочетании с нисходящим MS для характеристики белковых структур более высокого порядка специфическим для состояния или протеоформа способом8.
В этом документе описываются протоколы для этого подхода путем подробного описания этапов подготовки материала, экспериментальной процедуры и анализа данных. Факторы, которые могут повлиять на производительность метода или качество данных, перечислены в кратких примечаниях. Репрезентативные результаты, представленные здесь, включают дифференциальные данные HDX смесей различных белков и природных вариантов бычьего β-лактоглобулина (β-lg), основного сывороточного белка, присутствующего в молоке9. Мы демонстрируем эффективность разделения, воспроизводимость и производительность 2H-маркировки двух распространенных вариантов β-lg, т.е. A и B10,11 во время HDX на основе CE и характеризацию их конформаций для конкретных вариантов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цели покрытия внутренней стенки капилляра CE включают минимизацию электроосмотического потока и поглощения белка во время процессаCE 13. Хотя электроосмотический поток полезен для обычного анализа СЕ малых молекул из-за его способности направлять нейтральные или противоп?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC 21974069). Авторы также получили поддержку от Института клеточного анализа, Шэньчжэньская лаборатория залива, Китай; Цзянсуский коллаборативный инновационный центр биомедицинских функциональных материалов; и Ключевая лаборатория биомедицинских материалов Цзянсу в Нанкинском педагогическом университете, Китай.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
Referências
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Bioquímica. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Bioquímica. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
