ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価
Summary
HNSCCの同系マウスモデルにおけるIL-1αの抗腫瘍活性および関連する毒性を研究するための標準プロトコルが記載されている。
Abstract
サイトカイン療法は、がん患者に強力な抗腫瘍免疫応答を生み出すことができる有望な免疫療法戦略です。炎症誘発性サイトカインインターロイキン-1アルファ(IL-1α)は、いくつかの前臨床および臨床試験で抗がん剤として評価されています。しかし、インフルエンザのような症状や低血圧などの用量制限毒性は、この治療戦略への熱意を弱めています。IL-1αのポリ無水物ナノ粒子(NP)ベースの送達は、毒性副作用を低減しながら全身的にIL-1αのゆっくりと制御された放出を可能にする可能性があるため、この文脈では効果的なアプローチを表します。ここでは、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)同系マウスモデルにおけるIL-1α担持ポリ無水物NPsの抗腫瘍活性の解析について説明する。HPV16 E6/E7をhRASおよびルシフェラーゼ(mEERL)細胞とともに安定発現するマウス中咽頭上皮細胞をC57BL/6Jマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が任意の方向に3〜4 mmに達したら、1.5%IL-1aを装填した20:80の1,8-ビス(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン:1,6-ビス(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPTEG:CPH)ナノ粒子(IL-1α-NP)製剤をマウス腹腔内投与しました。腫瘍の大きさおよび体重は、腫瘍の大きさまたは体重減少が安楽死基準に達するまで連続的に測定された。血液サンプルを採取して顎下静脈穿刺による抗腫瘍免疫応答を評価し、炎症性サイトカインをサイトカインマルチプレックスアッセイで測定しました。腫瘍と鼠径リンパ節を切除し、単一細胞懸濁液にホモジナイズして、マルチカラーフローサイトメトリーでさまざまな免疫細胞を分析しました。これらの標準的な方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と免疫刺激NPの潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための他の免疫療法剤。
Introduction
がん免疫療法の新たな分野の1つは、炎症性サイトカインを使用して、腫瘍細胞に対する患者の免疫系を活性化することです。いくつかの炎症誘発性サイトカイン(すなわち、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターロイキン-2(IL-2)、およびインターロイキン-1(IL-1))は、重要な抗腫瘍免疫をマウントすることができ、サイトカインベースの薬物の抗腫瘍特性と安全性の探求に関心が寄せられています。特にインターロイキン-1α(IL-1α)は、炎症のマスターサイトカイン1として知られる炎症誘発性サイトカインである。1970年代後半にこのサイトカインが発見されて以来、化学療法の副作用を治療するための造血薬としてだけでなく、抗癌剤としても研究されてきました2。1980年代後半に、IL-1α 3,4,5,6の抗癌効果を決定するために、いくつかの前臨床および臨床試験が実施されました。これらの研究では、メラノーマ、腎細胞がん、および卵巣がんに対する組換えIL-1α(rIL-1α)の有望な抗腫瘍活性が見つかりました。ただし、発熱、吐き気、 ?? 吐、インフルエンザ様症状、および最も深刻な用量制限低血圧などの毒性が一般的に観察されました。.残念ながら、これらの用量関連毒性は、rIL-1αのさらなる臨床使用への熱意を弱めました。
IL-1α媒介毒性の重要な問題に対処するために、 表面侵食速度論によるIL-1αの制御放出を可能にするポリ無水物ナノ粒子(NP)製剤が調査されます。これらのNP製剤は、用量制限副作用を低減しながらIL−1αの抗腫瘍特性の利益を享受することを意図している7。ポリ無水物はFDA承認のポリマーであり、表面侵食によって分解し、カプセル化された薬剤のほぼゼロ次放出をもたらします8、9、10、11、12。1,8-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン(CPTEG)および1,6-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPH)を含む両親媒性ポリ無水物コポリマーは、腫瘍学および免疫学に基づく研究において、さまざまなペイロードの優れた送達システムであると報告されています8,12。次のプロトコル20:80では、1.5重量%のrIL-1α(IL-1α-NP)を搭載したCPTEG:CPH NPを使用して、このサイトカインの抗腫瘍活性と毒性を研究します HNSCCのマウスモデル。
以下の手順の全体的な目標は、HNSCCに対するIL-1α-NPの抗腫瘍活性を評価することです。記載された手順は、腫瘍の成長および生存を評価することを含む、関心のある任意の免疫調節剤に適用することができる。これらの手順は、臨床的関連性を最大化するために、無傷の免疫系13 を有する同系マウスモデルにおいて実施されるべきである。IL-1α-NP毒性は、炎症誘発性サイトカインの循環レベルと動物の体重の変化を測定することによっても評価されます。 in vivo 薬物毒性を決定する方法はたくさんあります。しかしながら、最も広く使用されている方法は、それらの器官における器官毒性および組織学的変化についての血清酵素の測定を含む。しかしながら、組織学的分析を行うには、動物を犠牲にする必要があり、それは実験の生存曲線に影響を与えるであろう。したがって、このプロトコルは、血清サンプル中のサイトカインの測定のための生きたマウスからの血液の収集のためのプロトコルを含むであろう。収集された血清は、臓器毒性に関する任意の所望の血清分析物の測定に使用することができる。マルチカラーフローサイトメトリーは、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の変化とリンパ節への免疫細胞の移動を理解するために使用されます。免疫組織化学および/または保存された切片の免疫蛍光を含む他の方法を利用して免疫細胞を同定することができる14。ただし、これらの手法は、多数の動物で実行するには時間がかかり、面倒な場合があります。全体として、以下の方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための免疫刺激剤。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルにより、研究者は抗腫瘍活性と免疫調節薬の根底にあるメカニズムのいくつかを研究することができます in vivo 腫瘍マウスモデルシステム。ここでは、同系皮下腫瘍モデルが使用されましたが、これは、技術的に簡単なプロトコル、腫瘍増殖の容易なモニタリング、動物の罹患率の低下、およびより高い産生性を含む、同所性モデルに比べていくつかの利点を有する。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、米国(米国)のメリットレビュー賞#I01BX004829によって部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス、アイオワ大学のホールデン総合がんセンターを通じたメジール賞プログラムの支援を受けています。
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Referências
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