माइक्रोग्रैविटी में दंत और श्वसन कोशिकाओं और अंगों का प्रसार
Summary
यह प्रोटोकॉल माइक्रोग्रैविटी में एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं की संस्कृति और 3 डी विकास के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है ताकि उनके लम्बी और ध्रुवीकृत आकार के साथ-साथ तामचीनी-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति को बनाए रखा जा सके। माइक्रोग्रैविटी में पीरियडोंटल इंजीनियरिंग संरचनाओं और फेफड़ों के अंगों की संस्कृति के लिए संस्कृति की स्थिति भी वर्णित है।
Abstract
गुरुत्वाकर्षण मानव कोशिका समारोह, प्रसार, साइटोस्केलेटल वास्तुकला और अभिविन्यास के प्रमुख निर्धारकों में से एक है। रोटरी बायोरिएक्टर सिस्टम (आरसीसीएस) गुरुत्वाकर्षण के नुकसान की नकल करते हैं क्योंकि यह अंतरिक्ष में होता है और इसके बजाय सुसंस्कृत कोशिकाओं या ऊतकों के निरंतर रोटेशन के माध्यम से एक माइक्रोग्रैविटी वातावरण प्रदान करता है। ये आरसीसीएस पोषक तत्वों, विकास और प्रतिलेखन कारकों और ऑक्सीजन की एक बाधित आपूर्ति सुनिश्चित करते हैं, और गतिहीन 2 डी (दो आयामी) सेल या अंग संस्कृति व्यंजनों में गुरुत्वाकर्षण बलों की कुछ कमियों को संबोधित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में हमने आरसीसीएस का उपयोग गर्भाशय ग्रीवा लूप कोशिकाओं और दंत लुगदी कोशिकाओं को एमेलोब्लास्ट बनने के लिए सह-संस्कृति करने, पीरियडोंटल पूर्वज / पाड़ इंटरैक्शन को चिह्नित करने और फेफड़ों के एल्वियोली पर सूजन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया है। आरसीसीएस वातावरण ने एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के विकास की सुविधा प्रदान की, पाड़ कोटिंग्स के जवाब में पीरियडोंटल पूर्वज प्रसार को बढ़ावा दिया, और सुसंस्कृत फेफड़ों के एल्वियोली पर भड़काऊ परिवर्तनों के प्रभावों के आकलन की अनुमति दी। यह पांडुलिपि पर्यावरणीय परिस्थितियों, सामग्रियों और रास्ते में चरणों को सारांशित करती है और महत्वपूर्ण पहलुओं और प्रयोगात्मक विवरणों पर प्रकाश डालती है। निष्कर्ष में, आरसीसीएस विट्रो में कोशिकाओं की संस्कृति और 3 डी (तीन आयामी) विकास में महारत हासिल करने और सेलुलर सिस्टम या इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देने के लिए अभिनव उपकरण हैं जो क्लासिक 2 डी संस्कृति वातावरण के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।
Introduction
गुरुत्वाकर्षण पृथ्वी पर जीवन के सभी पहलुओं को प्रभावित करता है, जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं के जीव विज्ञान और जीवों के भीतर उनके कार्य शामिल हैं। कोशिकाएं मेकेनोसेप्टर्स के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण को महसूस करती हैं और साइटोस्केलेटल आर्किटेक्चर को पुन: कॉन्फ़िगर करके और कोशिका विभाजन 1,2,3 को बदलकर गुरुत्वाकर्षण में परिवर्तन का जवाब देती हैं। माइक्रोग्रैविटी के अन्य प्रभावों में द्रव से भरे पुटिकाओं में हाइड्रोस्टेटिक दबाव, ऑर्गेनेल का अवसादन, और प्रवाहऔर गर्मी के उछाल-संचालित संवहन शामिल हैं। मानव कोशिकाओं और अंगों पर गुरुत्वाकर्षण के नुकसान के प्रभाव पर अध्ययन मूल रूप से अंतरिक्ष उड़ान मिशन5 के दौरान अंतरिक्ष यात्रियों पर अंतरिक्ष के भारहीन वातावरण का अनुकरण करने के लिए आयोजित किया गया था। हालांकि, हाल के वर्षों में, माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने के लिए नासा द्वारा मूल रूप से विकसित ये 3 डी बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकियां सेल आबादी की संस्कृति के लिए नए दृष्टिकोण के रूप में तेजी से प्रासंगिक हो रही हैं जो अन्यथा 2 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।
3 डी बायोरिएक्टर निलंबन में कोशिकाओं को बढ़ाकर माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करते हैं और इस प्रकार एक निरंतर “फ्री-फॉल” प्रभाव बनाते हैं। घूर्णन बायोरिएक्टर के अन्य लाभों में अंग संस्कृति प्रणालियों में हवा के संपर्क की कमी, कतरनी तनाव और अशांति में कमी और पोषक तत्वों की बदलती आपूर्ति के लिए निरंतर संपर्क शामिल है। रोटरी सेल कल्चर सिस्टम (आरसीसीएस) बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की गई ये गतिशील स्थितियां स्थानिक सह-स्थानीयकरण और एकल कोशिकाओं के तीन-आयामी संयोजन को समुच्चय 6,7 में अनुकूलित करती हैं।
पिछले अध्ययनों ने हड्डी पुनर्जनन 8, दांत रोगाणुसंस्कृति 9, और मानव दंत कूप कोशिकाओंकी संस्कृति के लिए रोटरी बायोरिएक्टर के फायदे का प्रदर्शनकिया है। एक रिपोर्ट यह भी बताती है कि आरसीसीएस ईओई सेल प्रसार और एमेलोब्लास्ट्स11 में भेदभाव को बढ़ाता है। हालांकि, विभेदित कोशिकाओं को उनके लम्बी आकृति विज्ञान या ध्रुवीकृत सेल आकार पर विचार किए बिना अकेले एमेलोब्लास्ट्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस और / या एमेलोजेनिन अभिव्यक्तिके आधार पर एमेलोब्लास्ट माना जाता था।
नासा द्वारा विकसित घूर्णन दीवार वाहिकाओं (आरडब्ल्यूवी) बायोरिएक्टर के अलावा, कोशिकाओं से 3 डी समुच्चय उत्पन्न करने के लिए अन्य तकनीकों में चुंबकीय उत्तोलन, यादृच्छिक स्थिति मशीन (आरपीएम) और क्लिनोस्टेट12 शामिल हैं। चुंबकीय उत्तोलन प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेबल की गई कोशिकाओं को बाहरी चुंबकीय बल का उपयोग करके ले जाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पाड़-मुक्त 3 डी संरचनाओं का निर्माण होता है जिनका उपयोग एडिपोसाइट संरचनाओं 13,14,15 के जैव निर्माण के लिए किया जाता है। माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने का एक और तरीका दो अक्षों के बारे में एक साथ रोटेशन को नियंत्रित करके बहुदिशात्मक जी बलों की पीढ़ी है जिसके परिणामस्वरूप क्लिनोस्टेट16 नामक डिवाइस के केंद्र में संचयी गुरुत्वाकर्षण वेक्टर को रद्द कर दिया जाता है। जब अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं को एक क्लिनोस्टेट में सुसंस्कृत किया गया था, तो ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दमन के माध्यम से नई हड्डी के गठन को रोक दिया गया था, जो माइक्रोग्रैविटी16 के विभेदक प्रभावों में से एक को दर्शाता है।
इन विट्रो सिस्टम एमेलोब्लास्ट्स की वफादार संस्कृति को सुविधाजनक बनाने के लिए दांत तामचीनी ऊतक इंजीनियरिंग की ओर एक बड़ा कदम प्रदानकरेंगे। दुर्भाग्यवश, आज तक, एमेलोब्लास्ट्स की संस्कृति एक चुनौतीपूर्णउपक्रम रहा है। अब तक, पांच अलग-अलग एमेलोब्लास्ट जैसी सेल लाइनों की सूचना मिली है, जिसमें माउस एमेलोब्लास्ट-वंश सेल लाइन (एएलसी), चूहे दंत उपकला कोशिका रेखा (एचएटी -7), माउस एलएस 8 सेल लाइन20, पोर्सिन पीएबीएसओ-ई सेल लाइन21 और चूहा एसएफ 2-24 सेल लाइन22 शामिल हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश कोशिकाओं ने 2 डी संस्कृति में अपने विशिष्ट ध्रुवीकृत सेल आकार को खो दिया है।
वर्तमान अध्ययन में हमने मेसेनकाइमल पूर्वजों के साथ सह-संवर्धित ग्रीवा लूप एपिथेलिया से एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के विकास को सुविधाजनक बनाने और गुरुत्वाकर्षण के कारण पोषक तत्वों के कम प्रवाह और साइटोस्केलेटल परिवर्तनों सहित 2 डी कल्चर सिस्टम की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक रोटरी सेल कल्चर बायोरिएक्टर सिस्टम (आरसीसीएस) की ओर रुख किया है। इसके अलावा, आरसीसीएस ने पीरियडोंटल ऊतक इंजीनियरिंग से संबंधित सेल / पाड़ इंटरैक्शन के अध्ययन और विट्रो में फेफड़ों के वायुकोशीय ऊतकों पर भड़काऊ मध्यस्थों के प्रभावों की जांच करने के लिए नए रास्ते प्रदान किए हैं। साथ में, इन अध्ययनों के परिणाम विभेदित एपिथेलिया के प्रसार के लिए माइक्रोग्रैविटी-आधारित रोटेटरी कल्चर सिस्टम के लाभों को उजागर करते हैं और विट्रो में उगाए गए कोशिकाओं पर पर्यावरणीय प्रभावों के आकलन के लिए, जिसमें सेल / पाड़ इंटरैक्शन और भड़काऊ स्थितियों के लिए ऊतक प्रतिक्रिया शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोग्रैविटी में कोशिकाओं के विकास के लिए प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में बायोरिएक्टर, पाड़, 3 डी संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं और सेल भेदभाव को प्रेरित करने के साधन के रूप में पाड़ ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (यूजी 3-डीई028869 और आर01-डीई027930) से अनुदान द्वारा उदारतापूर्वक समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
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