Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

Summary

Aqui relatamos um método de bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para biofabricagem de tecidos neurais para estudar a funcionalidade dos astrócitos no sistema nervoso central e os mecanismos que envolvem células gliais em doenças neurológicas e tratamentos.

Abstract

Os astrócitos são células gliais com um papel essencial no sistema nervoso central (SNC), incluindo suporte neuronal e funcionalidade. Essas células também respondem a lesões neurais e agem para proteger o tecido de eventos degenerativos. Estudos in vitro da funcionalidade dos astrócitos são importantes para elucidar os mecanismos envolvidos nesses eventos e contribuir para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos. Este protocolo descreve um método para biofabricar uma estrutura de tecido neural rica em astrócitos por bioimizades 3D carregados de astrócitos. Uma bioimpressora 3D baseada em extrusão foi usada neste trabalho, e os astrócitos foram extraídos dos cortices cerebrais dos filhotes de C57Bl/6. O bioink foi preparado pela mistura de astrócitos cortical de até a passagem 3 para uma solução biomaterial composta de gelatina, gelatina-methacryloyl (GelMA) e fibrinogênio, complementado com laminina, que apresentava condições ótimas de bioimpressão. As condições de bioimpressão 3D minimizaram o estresse celular, contribuindo para a alta viabilidade dos astrócitos durante o processo, em que 74,08% ± 1,33% das células eram viáveis logo após a bioimpressão. Após 1 semana de incubação, a viabilidade dos astrócitos aumentou significativamente para 83,54% ± 3,00%, indicando que o construto 3D representa um microambiente adequado para o crescimento celular. A composição do biomatélmico permitiu o apego celular e estimulou o comportamento astrócito, com células expressando os astrócitos específicos marcador de proteína ácida fibrilar glicial (GFAP) e possuindo morfologia astróctica típica. Este protocolo reprodutível fornece um método valioso para biofabricar tecido neural 3D rico em astrócitos que se assemelha ao microambiente nativo das células, útil para pesquisadores que visam entender a funcionalidade dos astrócitos e sua relação com os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas.

Introduction

Os astrócitos são o tipo celular mais abundante no Sistema Nervoso Central (SNC) e desempenham um papel fundamental na homeostase cerebral. Além do suporte neuronal duradouro, os astrócitos são responsáveis por modular a absorção de neurotransmissores, manter a integridade da barreira hematoencefálica e regular a sinapstogênese neuronal^1,2. Os astrócitos também têm um papel essencial na inflamação do SNC, respondendo a lesões no cérebro em um processo que leva à reatividade astrocativa ou astrogliose reativa^3,4, formando uma cicatriz gliar que impede a....

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram diretrizes internacionais para uso de animais em pesquisa (http://www.iclas.org) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019/9292090519).

1. Dissecção cerebral de camundongos

1. Transfira 10 mL de solução de sal tampão hanks frio (HBSS) para um prato de cultura de 100 mm e 1 mL para um microtubo de 1,5 mL. Prepare um microtubo por animal.
   NOTA: Tanto o prato de cultura quanto o microtubo precisam ser mantidos no gelo.
2. Prepare o meio de cultura dos astrócitos utilizando DMEM F12 + 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 2% gl....

Results

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um tecido neural usando a tecnologia de bioimpressão 3D para depositar gelatina carregada de astrócitos primários de camada por camada/GelMA/fibrinogen bioink. Os astrócitos foram extraídos e isolados do córtex cerebral de filhotes de camundongos(Figura 1),adicionados a uma composição biomaterial, permitindo a biofabricação de uma construção 3D viva.

O design auxiliado por computador (CAD) foi desenvolvido utilizando-se.......

Discussion

A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma alternativa de biofabricação que permite a engenharia de construtos refinados que se assemelham estrutural e fisiologicamente aos tecidos nativos²², incluindo o cérebro²³. A biofabricação de tecidos neurais permite a modelagem in vitro de microambientes nativos, sendo uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares associados ao desenvolvimento e tratamento de muitas doenças que afe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioimpressora 3D		biotecnologia 3D	Bioimpressora baseada em extrusão
Pinça de ponta romba	Integra Miltex	6--30	Fórceps para dissecção cerebral Albumina
de soro bovino	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Sem protease, sem ácidos graxos, essencialmente livre de globulina
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Frasco de cultura de células	Fisher Scientific	156340	Frasco de cultura T25
Filtro de células	Corning Incorporated	352340	Filtro de células 40 µ m
Microscópio confocal	Leica		Confocal TCS SP8 microscopia acoplada a um sistema confocal Olympus FluoView 300
Tubos cônicos	Thermo Scientific	339651, 339652	Tubos estéreis de 15 mL e 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	Solução de coloração DAPI
DMEM/F12	Gibco; Corporação de Tecnologias de Vida	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. De Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) com L-glutamina
Tubo de Dyalisis	Sigma-Aldrich	D9527	Corte de peso molecular = 14 kDa
Etanol	Fisher Scientific	64-15-5	Grau reagente
Soro Fetal Bovino	Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	Fibrinogênio de Grau de Pesquisa
	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogênio cristalino em pó de plasma bovino
Gelatina	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatina em pó de pele suína
Glicina	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glicina em pó
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	Sem cálcio, sem magnésio, sem fenol vermelho
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutamina pó cristalino
Laminina	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminina 1-2 mg/mL L em 50 mM Tris-HCl
Kit de imagem de células mortas	Thermo Scientific	R37601	Fluorescência verde em células vivas (ex/em 488 nm/515 nm). Fluorescência vermelha em células mortas (ex/em 570 nm/602 nm)
Anidrido metacrílico	Sigma-Aldrich	760-93-0	Para preparação de GelMA
Microtubos	Corning Incorporated	MCT-150-C	Microtubos de 1,5 mL
NaCl	Agulha Sigma-Aldrich	7647-14-5
22G	Fisher Scientific	NC1362045	Agulha romba estéril
Operação tesoura	Integra Miltex	05--02	Tesoura afiada para dissecção cerebral previamente esterilizada
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldeído em pó
Penicilina/Estreptomicina	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Estreptococos para caneta (5.000 unidades/ mL de penicilina; 5.000 ug/mL de estreptomicina)
Placa de Petri	Corning Incorporated	430591, 430588	Placas de Petri estéreis de 35 e 100 mm
Faloidina	Abcam	ab176753	iFluor 488 reagente
Fotoiniciador	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2- metilpropiofenona
Tampão fosfato solução salina (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, grau de cultura, sem cálcio, sem magnésio
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Hidrobrometo de poli-L-lisina mol peso 30,000-70,000
Antocorpo primário	Abcam	ab4674	Frango policlonal para GFAP
Anticorpo secundário	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594 anti-frango
Espátula	Miltex	V973-70	Espátula de cimento número 24 previamente esterilizada
Estereomicroscópio	Fisherbrand	3000038	Microscópio para dissecção cerebral
Seringa 5 mL	BD	1222C84	Seringa estéril
Filtro de seringa 2 µ m	Fisher Scientific	09-740-105	Filtro de polipropileno para esterilização
Trombina	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Trombina cristalina em pó de plasma bovino
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tripsina-EDTA	; Life Technologies Corporation	15400054	Tripsina sem vermelho de fenol 1 x diluído em solução PBS
Versene	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	Versene Solution (0,48 mM) formulado como 0,2 g EDTA (Na4) por litro de PBS Placa de
poço	Thermo Scientific	144530	Placa estéril de 24 poços