3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Summary

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

Abstract

Astrozyten sind Gliazellen mit einer wesentlichen Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), einschließlich neuronaler Unterstützung und Funktionalität. Diese Zellen reagieren auch auf neuronale Verletzungen und schützen das Gewebe vor degenerativen Ereignissen. In-vitro-Studien zur Funktionalität von Astrozyten sind wichtig, um die Mechanismen solcher Ereignisse aufzuklären und zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen beizutragen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Biofabrikation einer neuralen Gewebestruktur, die reich an Astrozyten ist, durch 3D-Bioprinting von Astrozyten-beladener Bioink. Ein extrusionsbasierter 3D-Bioprinter wurde in dieser Arbeit verwendet, und Astrozyten wurden aus den Gehirnkortexen von C57Bl/6 Mäusenwelpen extrahiert. Die Bioink wurde hergestellt, indem kortikale Astrozyten von bis Zurgang 3 zu einer Biomateriallösung aus Gelatine, Gelatine-Methacryloyl (GelMA) und Fibrinogen gemischt wurden, ergänzt mit Laminin, das optimale Bioprinting-Bedingungen aufwies. Die 3D-Bioprinting-Bedingungen minimierten den Zellstress und trugen zur hohen Lebensfähigkeit der Astrozyten während des Prozesses bei, bei dem 74,08% ± 1,33% der Zellen direkt nach dem Bioprinting lebensfähig waren. Nach 1 Woche Inkubation stieg die Lebensfähigkeit der Astrozyten signifikant auf 83,54% ± 3,00%, was darauf hindeutet, dass das 3D-Konstrukt eine geeignete Mikroumgebung für das Zellwachstum darstellt. Die Zusammensetzung des Biomaterials ermöglichte die Zellanheftung und stimulierte das astrozytäre Verhalten, wobei zellen den spezifischen Astrozytenmarker glial fibrillary acidic protein (GFAP) exprimierten und eine typische astrozytäre Morphologie besaßen. Dieses reproduzierbare Protokoll bietet eine wertvolle Methode zur Bioschmierung von 3D-neuralem Gewebe, das reich an Astrozyten ist und der nativen Mikroumgebung der Zellen ähnelt, nützlich für Forscher, die die Funktionalität von Astrozyten und ihre Beziehung zu den Mechanismen neurologischer Erkrankungen verstehen wollen.

Introduction

Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und spielen eine Schlüsselrolle bei der Homöostase des Gehirns. Neben der dauerhaften neuronalen Unterstützung sind Astrozyten für die Modulation der Aufnahme von Neurotransmittern, die Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und die Regulierung der neuronalen Synaptogenese verantwortlich^1,2. Astrozyten spielen auch eine wesentliche Rolle bei ZNS-Entzündungen und reagieren auf Verletzungen des Gehirns in einem Prozess, der zu einer Astrocitary-Reaktivität oder reaktiven Astrogliose führt^3,4 und bildet eine Glianarbe, die eine gesunde Gewebeexposition gegenüber degenerativen Agenzien verhindert⁵. Dieses Ereignis führt zu Veränderungen in der Genexpression, Morphologie und Funktion von Astrozyten^6,7. Daher sind Studien zur Funktionalität von Astrozyten hilfreich für die Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen.

In-vitro-Modelle sind entscheidend für die Untersuchung von Mechanismen im Zusammenhang mit neurologischen Verletzungen, und obwohl eine erfolgreiche Isolierung und zweidimensionale (2D) Kultur von kortikalen Astrozyten etabliert wurde⁸, bietet dieses Modell keine realistische Umgebung, die das native Zellverhalten nachahmt und die Komplexität des Gehirns reproduziert⁹ . Im 2D-Zustand beeinflussen die schlechte mechanische und biochemische Unterstützung, die geringen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und die Zellabflachung, die zum Fehlen einer basal-apikalen Polarität führt, die Zellsignaldynamik und die experimentellen Ergebnisse, was zu einer veränderten Zellmorphologie und Genexpression führt, was die Reaktion auf Behandlungen beeinträchtigt¹⁰. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Alternativen zu entwickeln, die eine realistischere neuronale Umgebung bieten, um die Ergebnisse in die Klinik zu übertragen.

Die dreidimensionale (3D) Zellkultur stellt ein fortschrittlicheres Modell dar, das mit erhöhter Genauigkeit merkmale von Organen und Geweben, einschließlich des ZNS^11,rekapituliert. In Bezug auf die Gliakultur tragen 3D-Modelle zur Aufrechterhaltung der Morphologie der Astrozyten, der basal-apikalen Polarität der Zellen und der Zellsignalisierung bei^12,13. Die 3D-Bioprinting-Technologie entwickelte sich zu einem leistungsstarken Werkzeug, um lebendes 3D-Gewebe kontrolliert zu biofabrizieren, indem Zellen und Biomaterialien verwendet werden, um die Struktur und Eigenschaften von nativem Gewebe nachzubilden. Der Einsatz dieser Technologie hat zu einer erheblichen Verbesserung der Ergebnisvorhersage geführt und zur regenerativen Medizin beigetragen, die auf die ZNS^14,15,16angewendet wird .

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur kortikaler Astrozyten. Das Protokoll beschreibt auch eine reproduzierbare Methode zum Bioprint von Astrozyten, die in Gelatine / Gelatine Methacryloyl (GelMA) / Fibrinogen eingebettet sind, ergänzt mit Laminin. In dieser Arbeit wurde ein extrusionsbasierter Bioprinter verwendet, um die Biomaterialzusammensetzung zu drucken, die kortikale Astrozyten mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen / ml enthält. Die Bioprinting-Scherspannung wurde durch die Kontrolle der Druckgeschwindigkeit minimiert, und Astrozyten zeigten nach dem Prozess eine hohe Lebensfähigkeit. Biogedruckte Konstrukte wurden 1 Woche lang kultiviert, und Astrozyten konnten sich innerhalb des Hydrogels ausbreiten, anheften und überleben, wobei die astrozytäre Morphologie beibehalten und ein spezifisches Marker-Glialfibrillär-saures Protein (GFAP) exprimiert wurde⁴.

Dieses Verfahren ist kompatibel mit kolbengetriebenen extrusionsbasierten Bioprintern und kann zum Biodrucken von Astrozyten aus verschiedenen Quellen verwendet werden. Das hier vorgeschlagene 3D-Bioprinted-Modell eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Neurotechnik, wie z.B. Studien der Mechanismen, die an der Funktionalität von Astrozyten in gesundem Gewebe beteiligt sind, und das Verständnis des Fortschreitens neurologischer Pathologien und der Behandlungsentwicklung.

Protocol

Alle Verfahren mit Tieren folgten den internationalen Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (http://www.iclas.org) und wurden vom Komitee für Ethik in der Forschung der Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519) genehmigt. 1. Gehirndissektion von Mäusen 10 ml kalte Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) in eine 100 mm Kulturschale und 1 ml in eine 1,5 ml Mikroröhre geben. Bereiten Sie eine Mikroröhrchen pro Tier vor.HINWEIS: Sowohl die Kult…

Representative Results

Diese Arbeit zielte darauf ab, ein neuralähnliches Gewebe zu entwickeln, das die 3D-Bioprinting-Technologie nutzt, um Schicht für Schicht primäre Astrozyten-beladene Gelatine / GelMA / Fibrinogen-Biotinte abzuscheiden. Astrozyten wurden extrahiert und aus der Großhirnrinde von Mäusewelpen isoliert (Abbildung 1), zu einer Biomaterialzusammensetzung hinzugefügt, die die Biofabrikation eines lebenden 3D-Konstrukts ermöglicht. Das Computer-Aided-Design (CAD) wu…

Discussion

Die 3D-Bioprinting-Technologie hat sich als Biofabrikationsalternative herausgestellt, die die Entwicklung verfeinerter Konstrukte ermöglicht, die strukturell und physiologisch nativen Geweben ähneln²², einschließlich des Gehirns²³. Die Biofabrikation von neuralähnlichen Geweben ermöglicht eine in vitro native Mikroumgebungsmodellierung und ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die mit der Entwicklung und Beha…

Materials

3D Bioprinter	3D Biotechnology Solutions		Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps	Integra Miltex	6–30	Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Cell culture flask	Fisher Scientific	156340	Culture flask T25
Cell strainer	Corning Incorporated	352340	Cell strainer 40 µm
Confocal microscope	Leica		Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes	Thermo Scientific	339651, 339652	Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	DAPI staining solution
DMEM/F12	Gibco; Life Technologies Corporation	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol	Fisher Scientific	64-15-5	Reagent grade
Fetal Bovine Serum	Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	Research Grade
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatin powder from porcine skin
Glycine	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutamine crystalline powder
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit	Thermo Scientific	R37601	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	760-93-0	For GelMA preparation
Microtubes	Corning Incorporated	MCT-150-C	Microtubes of 1,5 mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Needle 22G	Fisher Scientific	NC1362045	Sterile blunt needle
Operating scissor	Integra Miltex	05–02	Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish	Corning Incorporated	430591, 430588	Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin	Abcam	ab176753	iFluor 488 reagent
Photoinitiator	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody	Abcam	ab4674	Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula	Miltex	V973-70	Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope	Fisherbrand	3000038	Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL	BD	1222C84	Sterile syringe
Syringe filter 2 µm	Fisher Scientific	09-740-105	Polypropylene filter for sterilization
Thrombin	Sigma-Aldrich	9002–04-4	Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Laboratory grade
Trypsin-EDTA	Gibco; Life Technologies Corporation	15400054	Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate	Thermo Scientific	144530	Sterile 24-well plate