इंजीनियरिंग न्यूरल-जैसे ऊतक के लिए मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की 3डी बायोप्रिंटिंग
Summary
यहां हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों और उपचारों में ग्लियल कोशिकाओं से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका जैसे ऊतकों के लिए बायोफैब्रिकेट के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में एक आवश्यक भूमिका के साथ ग्लियल कोशिकाएं हैं, जिसमें न्यूरोनल समर्थन और कार्यक्षमता शामिल है। ये कोशिकाएं तंत्रिका चोटों का भी जवाब देती हैं और ऊतक को अपक्षयी घटनाओं से बचाने के लिए कार्य करती हैं। एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता के इन विट्रो अध्ययन ऐसी घटनाओं में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने और न्यूरोलॉजिकल विकारों के इलाज के लिए उपचार विकसित करने में योगदान देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल 3 डी बायोप्रिंटिंग एस्ट्रोसाइट्स-लादेन बायोइंक द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध तंत्रिका जैसी ऊतक संरचना को बायोफैब्रिकेट करने की विधि का वर्णन करता है। इस काम में एक एक्सट्रूशन-आधारित 3डी बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स C57Bl/6 चूहों पिल्ले के ब्रेन कॉर्टिस से निकाले गए थे । बायोइंक को कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को 3 से पारित होने तक जिलेटिन, जिलेटिन-मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) और फाइब्रिनोजेन से बना बायोमे्टरियल समाधान में मिलाकर तैयार किया गया था, जो लेमिनिन के साथ पूरक था, जिसने इष्टतम बायोप्रिंटिंग स्थितियां प्रस्तुत कीं। 3 डी बायोप्रिंटिंग स्थितियों ने सेल तनाव को कम किया, इस प्रक्रिया के दौरान एस्ट्रोसाइट्स की उच्च व्यवहार्यता में योगदान दिया, जिसमें बायोप्रिंटिंग के बाद 1.33% कोशिकाओं के 74.08% ± व्यवहार्य थे। इनक्यूबेशन के 1 सप्ताह के बाद, एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता काफी बढ़कर 3.00% ± 83.54% हो गई, जो यह दर्शाती है कि 3 डी निर्माण सेल विकास के लिए एक उपयुक्त माइक्रोएनवायरमेंट का प्रतिनिधित्व करता है। बायोमैटेरियल संरचना ने कोशिका लगाव और उत्तेजित एस्ट्रोसाइटिक व्यवहार की अनुमति दी, जिसमें कोशिकाओं ने विशिष्ट एस्ट्रोसाइट्स मार्कर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को व्यक्त किया और विशिष्ट एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान रखा। यह प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध 3 डी तंत्रिका जैसे ऊतक को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक मूल्यवान विधि प्रदान करता है जो कोशिकाओं के देशी माइक्रोएनवायरमेंट जैसा दिखता है, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है जिसका उद्देश्य एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों में शामिल तंत्र से उनके संबंध को समझना है।
Introduction
एस्ट्रोसाइट्स सेंट्रल नर्वस सिस्टम (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं और मस्तिष्क होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। स्थायी न्यूरोनल समर्थन के अलावा, एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोट्रांसमीटर तेज को मॉडुल करने, रक्त-मस्तिष्क बाधा अखंडता को बनाए रखने और न्यूरोनल सिनेप्टोजेनेसिस1,2को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। सीएनएस सूजन में एस्ट्रोसाइट्स की भी एक आवश्यक भूमिका होती है, जो मस्तिष्क को चोटों का जवाब देता है, जो एस्ट्रोसिटरी रिएक्टिविटी या प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोग्लियोसिस3,4की ओर जाता है, एक चमकदार निशान बनाता है जो अपक्षयी एजेंटों के स्वस्थ ऊतकों को उजागर करने से रोकता है5। इस घटना के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स की जीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन6, 7में परिवर्तनहोताहै। इसलिए, एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता से जुड़े अध्ययन न्यूरोलॉजिक विकारों के इलाज के लिए उपचारों के विकास के लिए सहायक हैं।
इन विट्रो मॉडल न्यूरोलॉजिकल चोटों से संबंधित तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और हालांकि कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की सफल अलगाव और दो-आयामी (2डी) संस्कृति8 स्थापितकी गई है, यह मॉडल एक यथार्थवादी वातावरण प्रदान करने में विफल रहता है जो देशी कोशिका व्यवहार की नकल करता है और मस्तिष्क की जटिलता को पुन: पेश करताहै 9 . 2डी स्थिति में, खराब यांत्रिक और जैव रासायनिक समर्थन, कम सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन, और सेल सपाट बेसल-एपिकल ध्रुवीकरण की अनुपस्थिति के लिए अग्रणी, सेल सिग्नलिंग गतिशीलता और प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित करता है जिससे सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति बदल जाती है, जो उपचार10के प्रति प्रतिक्रिया से समझौता करती है। इसलिए, यह विकल्प है कि एक और अधिक यथार्थवादी तंत्रिका वातावरण प्रदान विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्लिनिक के लिए परिणामों का अनुवाद करने के लिए लक्ष्य ।
त्रि-आयामी (3 डी) कोशिका संस्कृति एक अधिक उन्नत मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है जो सीएनएस11सहित अंगों और ऊतकों की बढ़ी हुई निष्ठा सुविधाओं के साथ पुनः मृत्यु हो जाती है। ग्लियल संस्कृति के बारे में, 3 डी मॉडल एस्ट्रोसाइट्स आकृति विज्ञान, सेल बेसल-एपिकल ध्रुवता, और सेल सिग्नलिंग12, 13के रखरखाव में योगदानदेतेहैं। 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक देशी ऊतकों की संरचना और गुणों को फिर से बनाने के लिए कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स का उपयोग करके नियंत्रित तरीके से 3 डी जीवित ऊतकों को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा। इस तकनीक के प्रयोग से परिणामों की भविष्यवाणी में काफी सुधार हुआ है और इसने सीएनएस14 , 15,16पर लागू पुनर्योजी दवा में योगदान दिया है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति का विवरण दिया गया है । प्रोटोकॉल में जिलेटिन/जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) /फाइब्रिनोजेन में एम्बेडेड एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि का भी विवरण दिया गया है, जो लेमिनिन के साथ पूरक है । इस काम में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स युक्त बायोमैटेरियल कंपोजिशन को प्रिंट करने के लिए एक्सट्रूस बेस्ड बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया । प्रिंटिंग की गति को नियंत्रित करके बायोप्रिंटिंग कतरनी तनाव को कम किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स ने प्रक्रिया के बाद उच्च व्यवहार्यता दिखाई। बायोप्रिंटेड निर्माण 1 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे, और एस्ट्रोसाइट्स हाइड्रोगेल के भीतर फैलने, संलग्न करने और जीवित रहने में सक्षम थे, एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान को बनाए रखते थे और एक विशिष्ट मार्कर ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी)4व्यक्त करते थे।
यह प्रक्रिया पिस्टन-संचालित एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर के साथ संगत है और इसका उपयोग विभिन्न स्रोतों से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए किया जा सकता है। यहां प्रस्तावित 3 डी बायोप्रिंटेड मॉडल तंत्रिका इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है, जैसे स्वस्थ ऊतकों में एस्ट्रोसाइट्स कार्यक्षमता में शामिल तंत्र का अध्ययन और न्यूरोलॉजिकल विकृतियों और उपचार विकास की प्रगति को समझना।
Protocol
Representative Results
Discussion
3डी बायोप्रिंटिंग तकनीक एक बायोफैब्रिकेशन विकल्प के रूप में उभरी है जो परिष्कृत निर्माणों की इंजीनियरिंग की अनुमति देता है जो संरचनात्मक और शारीरिक रूप से देशी ऊतकों के समानहोता है,जिसमें म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP), अनुदान संख्या 2018/23039-3 और 2018/12605-8 द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद (CNPq), अनुदान संख्या 465656/2014-5 और 309679/2018-4; और उच्च शिक्षा कर्मियों (CAPES), वित्तीय कोड 001 के सुधार के लिए समन्वय।
Materials
| 3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
| Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
| Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
| Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
| Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
| Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
| Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
| Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
| Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
| Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
| Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
| Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
| Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
| Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
| Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
| Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |
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