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Bioengenharia

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

Published: July 16, 2021
doi:
10.3791/62691
, , , ,
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina,Universidade Federal de São Paulo

Summary

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

Abstract

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 필수적인 역할을하는 신경 교세포이며 신경 지원 및 기능을 포함합니다. 이 세포는 또한 신경 상해에 반응하고 퇴행성 사건에서 조직을 보호하기 위하여 행동합니다. 성상 세포 ‘기능의 체외 연구에서 이러한 이벤트에 관련 된 메커니즘을 해명 하 고 신경 장애를 치료 하는 치료 개발에 기여 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜은 3D 바이오프린팅 성상세포-라덴 바이오잉크에 의해 성상세포가 풍부한 신경과 같은 조직 구조를 바이오패브릭화하는 방법을 설명합니다. 압출 기반 3D 바이오 프린터는이 작업에 사용되었고, 성상 세포는 C57Bl/6 마우스 새끼의 뇌 코르티체에서 추출되었다. 바이오잉크는 3번 통로까지 피질 성상세포를 젤라틴, 젤라틴-메타크라이로일(GelMA), 피브리노겐으로 구성된 생체재료 용액에 혼합하여 최적의 생체 인쇄 조건을 제시하였다. 3D 바이오프린팅 조건은 세포 스트레스를 최소화하여, 74.08%± 세포가 생체 인쇄 직후 실행 가능했던 공정 중 성상세포의 높은 생존가능성에 기여했습니다. 인큐베이션 1주 후, 성상세포의 생존가능성은 3.00%± 83.54%로 크게 증가하여 3D 구조가 세포 성장에 적합한 미세환경을 나타낸다는 것을 나타낸다. 생체 물질 조성은 세포 부착을 허용하고 성상체 행동을 자극, 세포는 특정 성상 세포 마커 신경교 세동 산성 단백질을 표현 (GFAP) 전형적인 성상체 형태를 소유. 이 재현 가능한 프로토콜은 세포의 기본 미세 환경과 유사한 성상 세포가 풍부한 3D 신경과 유사한 조직을 생체 제작하는 귀중한 방법을 제공하며, 성상세포기능및 신경질환과 관련된 메커니즘과의 관계를 이해하는 것을 목표로 하는 연구자들에게 유용합니다.

Introduction

성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포 유형 (CNS) 뇌 항상성에 중요한 역할을한다. 지속적인 신경 지원 이외에, 성상 세포는 신경 전달 물질 섭취량을 조절에 대 한 책임, 혈액-뇌 장벽 무결성유지,신경 시 냅 토 발생1,2조절. 성상 세포는 또한 CNS 염증에 필수적인 역할을, 점성 반응 성 반응성 점성구체3,4로이어지는 과정에서 뇌에 부상에반응,퇴행성 에이전트에 건강한 조직 박람회를 방지하는 신경교 흉터를 형성5. 이 이벤트는 성상세포의 유전자 발현, 형태학 및 기능6,7의변화를 초래한다. 따라서, 성상 세포 ‘ 기능을 관련 된 연구는 신경 질환을 치료 하는 치료의 개발에 대 한 도움이 됩니다.

체외 모델은 신경 상해와 관련된 메커니즘을 연구하는 데 매우 중요하며, 피질 성상세포의 성공적인 격리 및 2차원 (2D) 문화가 확립되었지만8,이 모델은 네이티브 세포 동작을 모방하고 뇌의 복잡성을 재현하는 현실적인 환경을 제공하지 못합니다9 . 2D 조건에서, 가난한 기계적 및 생화학적 지원, 낮은 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호 작용 및 기저 -정격 극성의 부재로 이어지는 세포 평탄화, 세포 신호 역학 및 변경 된 세포 형태및 유전자 발현으로 이어지는 실험 결과에 영향을 미치며, 이는 치료10에대한 반응을 타협한다. 따라서 결과를 클리닉으로 변환하는 것을 목표로 보다 현실적인 신경 환경을 제공하는 대안을 개발하는 것이 중요합니다.

3차원(3D) 세포 배양은 CNS11을포함한 장기 및 조직의 충실도 특징이 증가함에 따라 재구성되는 고급 모델을 나타낸다. 신경교 배양에 관해서는, 3D 모델은 성상세포 형태, 세포 기저-정성 극성 및 세포 신호12,13의유지에 기여한다. 3D 바이오프린팅 기술은 세포와 생체 물질을 사용하여 토착 조직의 구조와 특성을 재현하여 3D 살아있는 조직을 통제방식으로 바이오 패브릭화하는 강력한 도구로 떠올랐습니다. 이 기술의 사용은 결과 예측의 실질적인 개선을 주도하고 CNS14,15,16에적용되는 재생 의학에 기여하고있다.

여기에 설명된 프로토콜은 피질 성상세포의 격리및 배양에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 글라틴/젤라틴 메타크라이로일(GelMA)/피브리노겐에 내장된 생체 인쇄 성상세포에 대한 재현 가능한 방법을 자세히 설명하며, 라미닌으로 보충된다. 이 작품에서, 압출 계 바이오프린터는 1 x 106 세포/mL의 밀도로 피질 성상세포를 포함하는 생체 재료 조성물을 인쇄하는 데 사용되었다. 생체 프린팅 전단 응력은 인쇄 속도를 제어하여 최소화되었고, 성상세포는 공정 후 높은 생존력을 보였다. 생체 인쇄 구조는 1주 동안 배양되었고, 성상세포는 하이드로겔 내에서 확산, 부착 및 생존할 수 있었고, 성상체 형태를 유지하고 특정 마커 신경교 세동산성 단백질(GFAP)4를발현하였다.

이 절차는 피스톤 중심의 압출 기반 바이오 프린터와 호환되며 다양한 소스에서 파생된 성상 세포에 사용할 수 있습니다. 여기에서 제안된 3D 생체 인쇄 모형은 건강한 조직에 있는 성상세포 기능에 관련되었던 기계장치의 연구 및 신경 병리학 및 처리 발달의 진행을 이해하는 것과 같은 신경 공학 응용의 넓은 범위에 적합합니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 절차는 연구 (http://www.iclas.org)에서 동물 사용에 대한 국제 지침을 따랐으며 대학 연방 드 상파울루 (CEUA 2019 / 9292090519)의 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. 마우스 뇌 해부 차가운 행크스 버퍼드 솔트 솔루션(HBSS)을 100mm 배양 접시에 10mL, 1mL을 1.5mL 마이크로튜브로 옮춥니다. 동물당 마이크로튜브 1개를 준비합니다.참고: 문화 접시와 마이크…

Representative Results

이 작품은 3D 바이오 프린팅 기술을 사용하여 층별 1차 성상세포-라덴 젤라틴/GelMA/fibrinogen bioink를 증착하는 것을 목표로 했습니다. 성상세포는 생생물성분에 첨가된 마우스새끼(도 1)의대뇌 피질으로부터 추출및 분리되어 살아있는 3D 구조의 생체 제작을 가능하게 하였다. 컴퓨터 지원 설계(CAD)는 G-code(보충파일)를1mm의 기공을 가진 정사각형 …

Discussion

3D 바이오프린팅 기술은 구조적으로 생리적으로뇌(23)를포함한 토착조직(22)과유사한 정제 된 구조의 엔지니어링을 허용하는 생체 제작 대안으로 부상했습니다. 신경과 같은 조직의 생체 제조는 CNS 11에영향을 미치는 많은 질병의 개발 및 치료와 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 도구인 체외 네이티브 미세 환경 모델링?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 상파울루 연구 재단 (FAPESP), 교부금 번호 2018/23039-3 및 2018/12605-8에 의해 지원되었다; 국가 과학 기술 개발 위원회 (CNPq), 465656/2014-5 및 309679/2018-4를 부여; 및 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES), 금융 코드 001.

Materials

3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6–30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05–02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002–04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate
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Referências

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Citar este artigo
de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).
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