Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Abstract

Fibroblasten sind phänotypisch hochdynamische Zellen, die als Reaktion auf biochemische und biomechanische Reize schnell in Myofibroblasten transdifferenzieren. Das derzeitige Verständnis der fibrotischen Prozesse, einschließlich der Herzfibrose, ist nach wie vor schlecht, was die Entwicklung neuer antifibrotischer Therapien behindert. Kontrollierbare und zuverlässige menschliche Modellsysteme sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Fibrosepathologie. Dies ist ein hochgradig reproduzierbares und skalierbares Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe (ECT) in einer 48-Well-Gießplatte, um Studien von Fibroblasten und die Pathophysiologie von fibrotischem Gewebe in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu erleichtern. ECT werden um die Pole mit abstimmbarer Steifigkeit erzeugt, was Studien unter einer definierten biomechanischen Belastung ermöglicht. Unter den definierten Belastungsbedingungen können phänotypische Anpassungen, die durch Zell-Matrix-Wechselwirkungen gesteuert werden, untersucht werden. Parallele Tests sind im 48-Well-Format mit der Möglichkeit der Zeitverlaufsanalyse mehrerer Parameter wie Gewebeverdichtung und -kontraktion gegen die Belastung möglich. Aus diesen Parametern können biomechanische Eigenschaften wie Gewebesteifigkeit und Elastizität untersucht werden.

Introduction

Ein großes Hindernis bei der Untersuchung fibrotischer Erkrankungen ist das Fehlen repräsentativer menschlicher 3D-Gewebemodelle, die Einen einblick in das Verhalten von Fibroblasten und ihren pathologischen Derivaten geben. Um fibrotische Prozesse zu untersuchen, sind Standard-2D-Kultursysteme suboptimal, da isolierte Fibroblasten schnell in α-Glattmuskel-Aktin (SMA)-exprimierende Myofibroblasten transdifferenzieren, wenn sie auf nicht konformen 2D-Substraten kultiviert ^werden1,2,3. Somit spiegeln Fibroblasten in der Standard-2D-Kultur keinen regulären “gesunden” Gewebephänotyp wider3,4,5,6. Kulturen auf biegsamen Substraten wurden eingeführt, um nicht-fibrotische (10 kPa) und fibrotische (35 kPa) Gewebeumgebungen zu ^simulieren7, aber diesen fehlt die dritte Dimension, die in Bezug auf die Pathophysiologie sehr wichtig ist. Tissue Engineering bietet die Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden, indem es die Fibroblastenkultur in einem definierten und experimentell abstimmbaren extrazellulären Matrix (ECM)-Kontext ermöglicht, beispielsweise durch Veränderungen der Zellularität, der ECM-Zusammensetzung und der ECM-Konzentration, die alle die Gewebebiomechanik bestimmen können.

Verschiedene 3D-Modelle wurden mit Fibroblasten erzeugt. Schwimmende Scheiben und Mikrosphären gehörten zu den ersten und zeigen, dass Kollagen zeitabhängig umgebaut und verdichtet wird. Fibroblasten üben Zugkräfte auf Kollagenfibrillen aus, ein Prozess, der durch die Zugabe von profibrotischen Wirkstoffen wie transformierendem Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-β1) erleichtert werden kann.^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}. Frei schwebende Kulturen erlauben jedoch nicht die kontrollierte äußere Belastung und stellen daher kontinuierlich schrumpfende oder verdichtende Modelle dar. Sheet-like engineered tissues eröffneten die Möglichkeit, die homöostatische Regulation der biomechanischen Eigenschaften von Geweben zu untersuchen, nämlich durch uni-, bi-, multiaxiale oder zyklische Dehnungstests^17,18,19,20. Diese Modelle wurden z.B. verwendet, um den Einfluss der Zellzahl auf die Gewebesteifigkeit zu demonstrieren, die positiv mit der Integrität des Zytoskeletts und der Kontraktilität des Actomyosin-Zytoskeletts korreliert.^18,19. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Kraft-zu-Dehnungs-Umwandlungen durch die ungleichmäßige Gewebeverformung um Klemmpunkte von Kraftaufnehmern und Ankerpunkten erschwert werden. Diese inhärente Einschränkung kann durch Hundeknochen- oder ringförmige Gewebe umgangen werden, was eine gewisse Gewebeverstärkung an Ankerpunkten bietet^21,22,23. Ringförmige Gewebe können hergestellt werden, indem ein Zell-Kollagen-Hydrogel in ringförmige Formen verteilt wird. Wenn sich das Hydrogel verdichtet, bildet sich um den unkompressiblen inneren Stab der Form ein Gewebe, das Widerstand für eine weitere Gewebekontraktion bietet^24,25,26,27. Nach anfänglicher und typischerweise maximaler Verdichtung können Gewebe auch auf verstellbare Abstandshalter übertragen werden, um die kreisförmige EKT bei einer definierten Gewebelänge weiter zurückzuhalten.^{3,24,25,26,27,28,29,30}. Biophysikalische Eigenschaften können in horizontalen oder vertikalen Standard-Dehnungs-Vorrichtungen mit geeigneten Wägezellen unter unidirektionaler oder dynamischer Dehnung bewertet werden³. Da die Gewebe eine weitgehend gleichmäßige kreisförmige Struktur aufweisen und an Stangen/Haken (Verankerungspunkte und/oder Kraftaufnehmer) gehalten werden können, obwohl diese immer noch Kompressionsbereiche um die Ladestäbe herum einschließen können, ermöglicht dieses Format eine gleichmäßigere Dehnungsvariation im Vergleich zur Klemmung.³. Darüber hinaus lösen verankerte Gewebe eine bipolare Zellform aus, und Zellen passen sich den Gewebekräften an, indem sie entlang von Kraftlinien verlängert werden, um die anisotrope Traktion zu fördern.^{31,32,33,34,35,36}. Wir haben zuvor ringförmige EKT von ratten- und humanen Herzfibroblasten (CF) um einen einzigen steifen Pol in funktionellen Stressstammexperimenten angewendet und Studien zum Gewinn und Verlust von Funktionen unter Verwendung viral transduzierter Fibroblasten durchgeführt^24,25,26 und pharmakologische Studien³⁷. Darüber hinaus konnten wir Geschlechtsunterschiede bei CF-vermittelter Fibrose im ECT-Modell identifizieren²⁷.

Das folgende Protokoll für die Erzeugung menschlicher EKT, veranschaulicht durch primäre menschliche CF, die als kryokonservierte CF von kommerziellen Anbietern gewonnen wurde (siehe Materialtabelle), kombiniert die Vorteile ringförmiger Gewebe mit einer einfachen und schnellen Möglichkeit, makroskopisches Gewebe für eine 48-Well-Plattform herzustellen, die für parallele High-Content-Tests entwickelt wurde.

Wichtig ist, dass das ECT-Modell nicht auf einen bestimmten Fibroblastentyp beschränkt ist, mit der dokumentierten Verwendung bei der Untersuchung anderer Fibroblasten, z. B. Hautfibroblasten38,39. Darüber hinaus funktionieren Fibroblasten aus Patientenbiopsien gleich gut, und die Wahl der Fibroblasten hängt letztendlich von der zu behandelnden wissenschaftlichen Fragestellung ab.

Die Plattform, die für die in diesem Protokoll beschriebene ECT-Generierung verwendet wird, ist eine kommerziell erhältliche 48-Well-3D-Zell-/Gewebekulturplatte (Abbildung 1A). Die Methoden zur Vorbereitung, Kultivierung und Überwachung der ECT-Bildung und -Funktion unter definierter Geometrie und mechanischer Belastung mit Hilfe der 48-Well-Platte werden beschrieben. Die geformten ECT werden von integrierten flexiblen Polen gehalten und die mechanische Belastung kann entsprechend dem endgültigen Zweck fein abgestimmt werden, indem Stangen mit unterschiedlicher Härte (Shore A-Wert 36-89) verwendet werden, die ihre Biegesteifigkeiten beeinflussen. Pfähle mit Ufer Ein Wert von 46 wird empfohlen. Das Protokoll ist außerdem kompatibel mit einer zuvor beschriebenen benutzerdefinierten kreisförmigen Form, bei der die EKT um eine einzige steife Stange gehalten ^wird37. Die Abmessungen dieser Form sind in Abbildung 1B dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung von Gussformen. (A) Technische Zeichnung und Abmessungen einer Gießform mit zwei flexiblen Stangen. Die Form besteht aus einem inneren Umfang, der durch eine kurze Wand begrenzt wird, die doppelte Haltestangen am Hauptkörper der Form hält. Die flexiblen Pole haben einen freien horizontalen Abstand zueinander und sind an der Basis miteinander verbunden. Die Form ermöglicht 180 μL Gießvolumen. Die Vertiefung jeder Form ermöglicht eine Volumenkapazität von mindestens 600 μL Nährmedien. Verschiedene Materialzusammensetzungen können verwendet werden, um Pole mit spezifischen Steifigkeiten herzustellen (z. B. TM5MED-TM9MED). (B) Technische Zeichnung und Abmessungen einer ringförmigen Form mit einer einzigen steifen Stange. Dies ist eine alternative Form mit unterschiedlicher Geometrie und mechanischer Umgebung, die mit dem ECT-Gießprotokoll37 verwendet werden kann. Das ringförmige Formmontageverfahren wurde aus veröffentlichten größeren Formaten ^{angepasst28,41}. Kurz gesagt, das Verfahren umfasst (1) das Bedrucken von Polytetrafluorethylen (PTFE) -Formabstandhaltern (8 mm Durchmesser) in Polydimethylsiloxan (PDMS, Silikon), das in Glasschalen (Durchmesser 60 mm) gegossen wird, und (2) die konzentrische Befestigung eines PDMS-Polhalters (1,5 mm Durchmesser) innerhalb des geformten Hohlraums, der dazu dient, (3) eine abnehmbare Stange (Silikonschlauch mit 4 mm Durchmesser) zu halten. Der resultierende Hohlraum ermöglicht 180 μL Gießvolumen. Jede Glasschale kann mehrere bedruckte Formen aufnehmen (exemplarisch dargestellt mit 5 Formen) und hat die Kapazität für bis zu 5 ml Kulturmedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitshaube der Klasse II durchgeführt werden, die in Laboratorien der Sicherheitsstufe 1 installiert ist. Abhängig von den lokalen Vorschriften und der Art der durchzuführenden Manipulationen, wie z. B. der viral vermittelte Gentransfer, muss der Containment-Level auf die Biosicherheitsstufe 2 oder 3 erhöht werden. Alle Kulturen werden bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 in der Luft gehalten. Beachten Sie, dass die V…

Representative Results

ECT erreichen innerhalb der ersten 24 h eine Verdichtung von rund 95 % im Vergleich zum anfänglichen Zell-Kollagen-Hydrogel-Volumen. Gewebeverdichtung und -kontraktion unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von FCS erfolgt einige Stunden nach dem Gießen und nimmt bis Tag 5 deutlich zu (Abbildung 5A). Die Polauslenkung kann in den folgenden 15 Tagen weiter zunehmen (20 Tage waren die längste getestete Zeit). Das Ausmaß der Polablenkung hängt vom Zelltyp, dem Zellzustand sowie den Zel…

Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Erzeugung von ECT aus primärer menschlicher CF, die es ermöglicht, die mechanischen Auswirkungen dieser Zellen auf ihre extrazelluläre Matrixumgebung und umgekehrt zu untersuchen.

Die Fibroblasten müssen erweitert werden, um genügend Zellen für die geplanten ECT-Experimente (0,75 x ¹⁰⁶ Zellen/ECT) zu erhalten. Für die beste Reproduzierbarkeit wird empfohlen, gefrorene oder aus Gewebe gewonnene Fibroblasten in 2D-Monolayer-Kultur für …

Materials

Cell culture reagents:
Accutase Solution	Merk Millipore	SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express	Gibco	12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose	Gibco	12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+	Gibco	14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium	Lonza	CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors	Lonza	CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT	PromoCell	C-23130
Fibroblast Basal Medium 3	PromoCell	C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack	PromoCell	C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL)	Gibco	15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)	Lonza	CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)	PromoCell	C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)	PromoCell	C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)	ATCC	SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl	LLC Collagen Solutions	FS22024	6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl	Corning	354236	~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A)	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware	Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm)	Falcon	352340
myrPlate-uniform	myriamed GmbH	TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)	Corning	07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors	OptoEngineering	TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024	Basler	107404