Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Gabriela L. Santos; Tim Meyer; Malte Tiburcy; Alisa DeGrave; Wolfram-Hubertus Zimmermann; Susanne Lutz

doi:10.3791/62700

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Bioengineering

फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न मानव इंजीनियर संयोजी ऊतक स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए

Published: August 20, 2021

doi:

10.3791/62700

Gabriela L. Santos², Tim Meyer², Malte Tiburcy², Alisa DeGrave², Wolfram-Hubertus Zimmermann^2,3,4,5, Susanne Lutz²

¹Institute of Pharmacology and Toxicology,University Medical Center Goettingen, ²DZHK (German Center for Cardiovascular Research) partner site, Goettingen, ³Cluster of Excellence “Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells” (MBExC),University of Goettingen, ⁴Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), ⁵Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology (ITMP)

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया एक प्रोटोकॉल है जो दोहरे ध्रुवों के साथ एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट में 48 ऊतकों की समानांतर संस्कृति के लिए इंजीनियर संयोजी ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए है, जो यांत्रिक अध्ययन, रोग मॉडलिंग और स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल विभिन्न अंगों और प्रजातियों से फाइब्रोब्लास्ट के साथ संगत है और यहां मानव प्राथमिक कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के साथ उदाहरण दिया गया है।

Abstract

फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइपिक रूप से अत्यधिक गतिशील कोशिकाएं हैं, जो जैव रासायनिक और बायोमैकेनिकल उत्तेजनाओं के जवाब में मायोफाइब्रोब्लास्ट्स में जल्दी से ट्रांसडिफरेंटिएट होती हैं। कार्डियक फाइब्रोसिस सहित फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं की वर्तमान समझ खराब बनी हुई है, जो नए एंटी-फाइब्रोटिक उपचारों के विकास में बाधा डालती है। फाइब्रोसिस पैथोलॉजी की बेहतर समझ के लिए नियंत्रणीय और विश्वसनीय मानव मॉडल सिस्टम महत्वपूर्ण हैं। यह एक अत्यधिक पुनरुत्पादक और स्केलेबल प्रोटोकॉल है जो 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में इंजीनियर संयोजी ऊतकों (ईसीटी) को उत्पन्न करने के लिए है ताकि फाइब्रोब्लास्ट्स के अध्ययन और 3-आयामी (3 डी) वातावरण में फाइब्रोटिक ऊतक के पैथोफिजियोलॉजी के अध्ययन की सुविधा हो सके। ईसीटी को ट्यूनेबल कठोरता के साथ ध्रुवों के चारों ओर उत्पन्न किया जाता है, जो एक परिभाषित बायोमैकेनिकल लोड के तहत अध्ययन की अनुमति देता है। परिभाषित लोडिंग स्थितियों के तहत, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन द्वारा नियंत्रित फेनोटाइपिक अनुकूलन का अध्ययन किया जा सकता है। समानांतर परीक्षण 48-अच्छी तरह से प्रारूप में कई मापदंडों के समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण के अवसर के साथ संभव है, जैसे कि ऊतक संघनन और लोड के खिलाफ संकुचन। इन मापदंडों से, ऊतक कठोरता और लोच जैसे बायोमैकेनिकल गुणों का अध्ययन किया जा सकता है।

Introduction

फाइब्रोटिक रोगों के अध्ययन में एक बड़ी बाधा प्रतिनिधि मानव 3 डी ऊतक मॉडल की कमी है जो फाइब्रोब्लास्ट और उनके पैथोलॉजिकल डेरिवेटिव के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, मानक 2 डी संस्कृति प्रणालियां उप-इष्टतम हैं क्योंकि अलग-थलग फाइब्रोब्लास्ट्स तेजी से α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) में स्थानांतरित हो जाते हैं – गैर-अनुपालन 2 डी सब्सट्रेट्स ^1,2,3 पर सुसंस्कृत होने पर मायोफाइब्रोब्लास्ट्स को व्यक्त करते हैं। इस प्रकार, मानक 2 डी संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट एक नियमित रूप से “स्वस्थ” ऊतक फेनोटाइप ^3,4,5,6 को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। लचीले सब्सट्रेट पर संस्कृतियों को गैर-फाइब्रोटिक (10 केपीए) और फाइब्रोटिक (35 केपीए) ऊतक वातावरण ⁷ का अनुकरण करने के लिए पेश किया गया है, लेकिन इनमें तीसरे आयाम की कमी है, जो पैथोफिजियोलॉजी के संबंध में बहुत महत्वपूर्ण है। ऊतक इंजीनियरिंग एक परिभाषित और प्रयोगात्मक रूप से tunable extracellular मैट्रिक्स (ECM) में फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की अनुमति देकर इस सीमा को दूर करने का अवसर प्रदान करता है- संदर्भ, उदाहरण के लिए, सेलुलरता, ईसीएम संरचना और ईसीएम एकाग्रता में परिवर्तन द्वारा, जिनमें से सभी ऊतक बायोमैकेनिक्स निर्धारित कर सकते हैं।

फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके विभिन्न 3 डी मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। फ्लोटिंग डिस्क और माइक्रोस्फीयर पहले में से थे और यह दर्शाते हैं कि कोलेजन को समय-निर्भर तरीके से फिर से तैयार और कॉम्पैक्ट किया जाता है। फाइब्रोब्लास्ट्स कोलेजन फाइब्रिल पर कर्षण बल लगाते हैं, एक ऐसी प्रक्रिया जिसे प्रो-फाइब्रोटिक एजेंटों के अलावा सुविधाजनक बनाया जा सकता है जैसे कि विकास कारक-बीटा 1 (टीजीएफ-π1) को बदलना⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. हालांकि, स्वतंत्र रूप से फ्लोटिंग संस्कृतियां नियंत्रित बाहरी लोडिंग की अनुमति नहीं देती हैं और इसलिए, लगातार सिकुड़ने या कॉम्पैक्टिंग मॉडल का गठन करती हैं। शीट जैसे इंजीनियर ऊतकों ने ऊतकों के बायोमैकेनिकल गुणों के होमोस्टेटिक विनियमन का अध्ययन करने की संभावना को खोला, अर्थात् यूनि, द्वि, बहुअक्षीय, या चक्रीय तनाव परीक्षण के माध्यम से¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. इन मॉडलों का उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, ऊतक कठोरता पर सेल संख्या के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, जो साइटोस्केलेटन अखंडता और एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन संकुचन के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित पाया गया था।¹⁸^,¹⁹. हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बल-से-तनाव रूपांतरण बल ट्रांसड्यूसर और एंकर बिंदुओं के क्लैंप बिंदुओं के आसपास गैर-समान ऊतक विरूपण द्वारा जटिल होते हैं। इस अंतर्निहित सीमा को कुत्ते की हड्डी या अंगूठी के आकार के ऊतकों द्वारा दरकिनार किया जा सकता है, जो लंगर-बिंदुओं पर कुछ ऊतक प्रवर्तन की पेशकश करता है²¹^,²²^,²³. रिंग के आकार के ऊतकों को रिंग के आकार के मोल्ड्स में सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल वितरित करके तैयार किया जा सकता है। जैसा कि हाइड्रोजेल कॉम्पैक्ट करता है, मोल्ड के असम्पीडित आंतरिक रॉड के चारों ओर एक ऊतक बनता है, जो आगे ऊतक संकुचन के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷. प्रारंभिक और आमतौर पर अधिकतम संघनन के बाद, ऊतकों को एक परिभाषित ऊतक लंबाई पर परिपत्र ईसीटी को और अधिक रोकने के लिए समायोज्य स्पेसर्स को भी स्थानांतरित किया जा सकता है³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰. जैव भौतिक गुणों का मूल्यांकन मानक क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर तनाव-तनाव उपकरणों में यूनिडायरेक्शनल या गतिशील तनाव के तहत उपयुक्त लोड कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है³. चूंकि ऊतकों में काफी हद तक एक समान परिपत्र संरचना होती है और इसे सलाखों / हुक (एंकरेज पॉइंट्स और / या फोर्स ट्रांसड्यूसर) पर आयोजित किया जा सकता है, हालांकि ये अभी भी लोडिंग सलाखों के आसपास संपीड़न क्षेत्रों को संलग्न कर सकते हैं, यह प्रारूप क्लैंपिंग की तुलना में अधिक समान तनाव भिन्नता की अनुमति देता है।³. इसके अलावा, लंगर डाले हुए ऊतक एक द्विध्रुवी कोशिका आकार प्राप्त करते हैं, और कोशिकाएं अनिसोट्रोपिक कर्षण को बढ़ावा देने वाली बल रेखाओं के साथ बढ़ाव द्वारा ऊतक बलों के अनुकूल होती हैं³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. हमने पहले कार्यात्मक तनाव-तनाव प्रयोगों में एक ही कठोर ध्रुव के चारों ओर चूहे और मानव कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ) से अंगूठी के आकार के ईसीटी को लागू किया है और वायरल रूप से ट्रांसड्यूस्ड फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके फ़ंक्शन अध्ययन के लाभ और हानि का प्रदर्शन किया है।²⁴^,²⁵^,²⁶ और औषधीय अध्ययन³⁷. इसके अलावा, हम ईसीटी मॉडल में सीएफ-मध्यस्थता फाइब्रोसिस में सेक्स मतभेदों की पहचान कर सकते हैं²⁷.

मानव ईसीटी की पीढ़ी के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल, वाणिज्यिक विक्रेताओं से क्रायोप्रिजर्व्ड सीएफ के रूप में प्राप्त प्राथमिक मानव सीएफ के साथ उदाहरण दिया गया है ( सामग्री की तालिका देखें), समानांतर उच्च-सामग्री परीक्षण के लिए डिज़ाइन किए गए 48-अच्छी तरह से मंच के लिए मैक्रोस्कोपिक ऊतकों के उत्पादन के एक आसान और तेज़ तरीके के साथ अंगूठी के आकार के ऊतकों के लाभों को जोड़ता है।

महत्वपूर्ण रूप से, ईसीटी मॉडल एक विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट प्रकार तक सीमित नहीं है, अन्य फाइब्रोब्लास्ट की जांच में प्रलेखित उपयोग के साथ, उदाहरण के लिए, त्वचा फाइब्रोब्लास्ट38,39। इसके अलावा, रोगी की बायोप्सी से फाइब्रोब्लास्ट समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं, और फाइब्रोब्लास्ट की पसंद अंततः संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करती है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित ईसीटी की पीढ़ी के लिए उपयोग किया जाने वाला मंच एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 48-अच्छी तरह से 3 डी सेल / टिश्यू कल्चर प्लेट (चित्रा 1 ए) है। 48-वेल प्लेट की मदद से एक परिभाषित ज्यामिति और यांत्रिक लोड के तहत ईसीटी गठन और कार्य की तैयारी, खेती और निगरानी के तरीकों का वर्णन किया गया है। गठित ईसीटी को एकीकृत लचीले ध्रुवों द्वारा आयोजित किया जाता है और यांत्रिक भार को विभिन्न कठोरता (शोर ए मान 36-89) के साथ ध्रुवों का उपयोग करके अंतिम उद्देश्य के अनुसार ठीक किया जा सकता है, जो उनके झुकने वाली कठोरताओं को प्रभावित करता है। एक किनारे के साथ डंडे 46 के एक मान की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल, इसके अलावा, पहले से वर्णित कस्टम परिपत्र मोल्ड के साथ संगत है, जहां ईसीटी को एक एकल कठोर रॉड ³⁷ के आसपास आयोजित किया जाता है। इस साँचे के आयाम चित्र 1B में दिए गए हैं।

चित्रा 1: कास्टिंग molds के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) तकनीकी ड्राइंग और दो लचीले ध्रुवों के साथ एक कास्टिंग मोल्ड के आयाम। मोल्ड में एक आंतरिक परिधि शामिल है जो एक छोटी दीवार द्वारा सीमांकित होती है जो मोल्ड के मुख्य शरीर पर डबल रिटेनिंग पोल रखती है। लचीले ध्रुवों में एक दूसरे के लिए एक मुक्त क्षैतिज दूरी होती है और आधार पर जुड़े होते हैं। मोल्ड 180 μL कास्टिंग मात्रा के लिए अनुमति देता है। प्रत्येक मोल्ड का कुआं संस्कृति मीडिया के कम से कम 600 μL की मात्रा क्षमता की अनुमति देता है। विभिन्न सामग्री रचनाओं का उपयोग विशिष्ट कठोरता (उदाहरण के लिए, TM5MED-TM9MED) के साथ ध्रुवों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। (बी) तकनीकी ड्राइंग और एक एकल कठोर छड़ी के साथ एक अंगूठी के आकार के मोल्ड के आयाम। यह अलग ज्यामिति और यांत्रिक वातावरण के साथ एक वैकल्पिक मोल्ड है, जिसका उपयोग ईसीटी कास्टिंग प्रोटोकॉल ³⁷ के साथ किया जा सकता है। अंगूठी के आकार की मोल्ड असेंबली विधि को प्रकाशित बड़े प्रारूपों ^28,41 से अनुकूलित किया गया था। संक्षेप में, इस विधि में (1) पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) मोल्डिंग स्पेसर्स (8 मिमी व्यास) को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस, सिलिकॉन) में कांच के व्यंजनों (व्यास 60 मिमी) में डाला गया है, और (2) पीडीएमएस पोल होल्डर (1.5 मिमी व्यास) को गठित खोखले गुहा के अंदर संकेंद्रित रूप से ठीक करना शामिल है, जो (3) एक हटाने योग्य ध्रुव (4 मिमी व्यास सिलिकॉन ट्यूब) को पकड़ने के लिए कार्य करता है। खोखले अंतरिक्ष परिणामस्वरूप कास्टिंग मात्रा के 180 μL के लिए अनुमति देता है। प्रत्येक ग्लास डिश कई मुद्रित मोल्ड्स (अनुकरणीय रूप से 5 मोल्ड्स के साथ दिखाया गया है) को कॉम्पोर्ट कर सकता है और इसमें 5 मिलीलीटर तक की संस्कृति माध्यम की क्षमता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

रोकथाम स्तर 1 के तहत प्रयोगशालाओं में स्थापित कक्षा II जैव सुरक्षा हुड में सभी कदम उठाए जाने चाहिए। स्थानीय नियमों और प्रदर्शन किए जाने वाले जोड़तोड़ के प्रकार के आधार पर, जैसे कि वायरल-मध्यस्थता जीन हस?…

Representative Results

ईसीटी पहले 24 घंटे के भीतर प्रारंभिक सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल वॉल्यूम की तुलना में लगभग 95% संघनन तक पहुंचता है। नियंत्रण की स्थिति में और एफसीएस की उपस्थिति में ऊतक संघनन और संकुचन कास्टिंग के कुछ घंटों बा?…

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव सीएफ से ईसीटी की पीढ़ी का वर्णन करता है, जो इन कोशिकाओं के यांत्रिक प्रभाव का अध्ययन उनके बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स वातावरण पर और इसके विपरीत करने की अनुमति देता है।

<p …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को जर्मन कार्डियक सोसाइटी (जीएलएस के लिए डीजीके रिसर्च फैलोशिप) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (जीएलएस और एडी के लिए परियोजना आईआरटीजी 1816 के माध्यम से डीएफजी) द्वारा समर्थित किया गया था; एमटी के लिए डीएफजी 417880571 और डीएफजी टीआई 956/1-1; एमटी और डब्ल्यूएचजेड के लिए एसएफबी 1002 टीपी सी04; WHZ के लिए SFB 1002 TP S01; और WHZ के लिए EXC 2067/1-390729940J)। WHZ विज्ञान और शिक्षा के लिए जर्मन संघीय मंत्रालय (परियोजना IndiHEART के माध्यम से BMBF), और Fondation Leducq (20CVD04) द्वारा समर्थित है। MT, WHZ और SL जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (DZHK) द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Cell culture reagents:
Accutase Solution	Merk Millipore	SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express	Gibco	12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose	Gibco	12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+	Gibco	14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium	Lonza	CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors	Lonza	CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT	PromoCell	C-23130
Fibroblast Basal Medium 3	PromoCell	C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack	PromoCell	C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL)	Gibco	15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)	Lonza	CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)	PromoCell	C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)	PromoCell	C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)	ATCC	SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl	LLC Collagen Solutions	FS22024	6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl	Corning	354236	~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A)	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware	Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm)	Falcon	352340
myrPlate-uniform	myriamed GmbH	TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)	Corning	07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors	OptoEngineering	TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024	Basler	107404

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Santos, G. L., Meyer, T., Tiburcy, M., DeGrave, A., Zimmermann, W., Lutz, S. Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications. J. Vis. Exp. (174), e62700, doi:10.3791/62700 (2021).