En skalerbar model til at studere virkningerne af Blunt-Force Skade i voksen zebrafisk

Summary

Vi ændrede Marmarou vægtdråbemodellen for voksne zebrafisk for at undersøge en bredde af patologier efter stump-force traumatisk hjerneskade (TBI) og de mekanismer, der ligger til grund for efterfølgende neuronal regenerering. Denne stump-kraft TBI model er skalerbar, inducerer en mild, moderat, eller svær TBI, og opsummerer skade heterogenitet observeret i human TBI.

Abstract

Blunt-force traumatiske hjerneskader (TBI) er den mest almindelige form for hovedtraume, som spænder over en række sværhedsgrader og resulterer i komplekse og heterogene sekundære virkninger. Mens der ikke er nogen mekanisme til at erstatte eller regenerere de tabte neuroner efter en TBI hos mennesker, zebrafisk besidder evnen til at regenerere neuroner i hele deres krop, herunder hjernen. For at undersøge bredden af patologier, der udvises i zebrafisk efter en stump kraft TBI og for at studere de mekanismer, der ligger til grund for det efterfølgende neuronalt regenerativt respons, ændrede vi det almindeligt anvendte gnaver Marmarou vægtfald til brug i voksne zebrafisk. Vores enkle stump-kraft TBI model er skalerbar, fremkalde en mild, moderat, eller svær TBI, og recapitulates mange af de fænotyper observeret efter menneskelige TBI, såsom kontakt- og posttraumatiske anfald, ødem, subdural og intracerebral hæmatomer, og kognitive funktionsnedsættelser, hver vises i en skade sværhedsgrad-afhængige måde. TBI sequelae, som begynder at dukke op inden for få minutter efter skaden, stilne af og vende tilbage til næsten ubeskadigede kontrolniveauer inden for 7 dage efter skaden. Den regenerative proces begynder så tidligt som 48 timer efter skade (hpi), med peak celle spredning observeret af 60 hki. Således producerer vores zebrafisk stump kraft TBI-model karakteristiske primære og sekundære skade TBI patologier svarende til human TBI, som giver mulighed for at undersøge sygdomsdebut og progression sammen med mekanismerne for neuronal regenerering, der er unik for zebrafisk.

Introduction

Traumatiske hjerneskader (TBI) er en global sundhedskrise og en førende årsag til død og handicap. I USA oplever ca. 2,9 millioner mennesker en TBI hvert år, og mellem 2006-2014 steg dødeligheden på grund af TBI eller TBI-følgevirkninger med over 50%¹. Men, TBIs varierer i deres ætiologi, patologi, og klinisk præsentation skyldes i høj grad delvis til dels til skadesmekanismen (MOI), som også påvirker behandlingsstrategier og forudsagt ^prognose2. Selvom TBIs kan skyldes forskellige MOI, de er overvejende resultatet af enten en gennemtrængende eller stump-kraft traumer. Gennemtrængende traumer repræsenterer en lille procentdel af TBIs og generere en alvorlig og fokal skade, der er lokaliseret til den umiddelbare og omkringliggende spiddet hjerne ^regioner3. I modsætning hertil, stump-kraft TBIs er mere almindelige i den almindelige befolkning, spænder over en række sværhedsgrader (mild, moderat, og svær), og producere en diffus, heterogen, og global skade påvirker flere hjerne ^{regioner1,4,5}.

Zebrafisk (Danio rerio) er blevet brugt til at undersøge en bred vifte af neurologiske fornærmelser spænder over centralnervesystemet (CNS) 6,7,8,9. Zebrafisk har også, i modsætning til pattedyr, en medfødt og robust regenerativ reaktion på at reparere CNS ^damage10. Nuværende zebrafisk traumer modeller bruger forskellige skade metoder, herunder penetration, excision, kemisk fornærmelse, eller trykbølger11,12,13,14,15,16. Men hver af disse metoder udnytter en MOI, der sjældent opleves af den menneskelige befolkning, er ikke skalerbar på tværs af en række skade sværhedsgrader, og ikke løse heterogenitet eller sværhedsgrad-afhængige TBI følgevirkninger rapporteret efter stump kraft TBI. Disse faktorer begrænser brugen af zebrafiskmodellen til at forstå de underliggende mekanismer i patologierne forbundet med den mest almindelige form for TBI i den menneskelige befolkning (milde stumpe kraftskader).

Vi havde til formål at udvikle en hurtig og skalerbar stump kraft TBI zebrafisk model, der giver muligheder for at undersøge skade patologi, progression af TBI følgevirkninger, og den medfødte regenerative respons. Vi ændrede den almindeligt anvendte gnaver ^Marmarou17 vægtdråbe og anvendte den på voksne zebrafisk. Denne model giver en reproducerbar vifte af sværhedsgrader lige fra mild, moderat, til svær. Denne model også generoler flere facetter af menneskelige TBI patologi, i en sværhedsgrad-afhængige måde, herunder anfald, ødem, subdural og intracerebral hæmatomer, neuronal celledød, og kognitive underskud, såsom læring og hukommelse værdiforringelse. Dage efter skade, patologier og underskud spredes, vender tilbage til niveauer, der ligner ubeskadigede kontrol. Derudover, denne zebrafisk model viser en robust spredning og neuronal regenerering svar på tværs af neuroaxis om skade sværhedsgrad.

Her giver vi detaljer mod opsætning og induktion af stump-force traumer, scoring posttraumatisk anfald, vurdering af vaskulære skader, instruktioner om forberedelse af hjerne sektioner, tilgange til kvantificering ødem, og indsigt i den proliferative reaktion efter skade.

Protocol

Zebrafisk blev opdrættet og vedligeholdt i Notre Dame Zebrafish facilitet i Freimann Life Sciences Center. De metoder, der er beskrevet i dette manuskript blev godkendt af University of Notre Dame Animal Care and Use Committee. 1. Traumatisk hjerneskade paradigme Tilsæt 1 mL 2-phenoxyethanol til 1 L systemvand (60 mg Instant Ocean i 1 L deioniseret RO-vand). Forbered en besat opvindingstank, der indeholder 2 L systemvand ved stuetemperatur. Vælg den ønskede v?…

Representative Results

Forberedelse af skade-induktion rigg giver mulighed for en hurtig og forenklet middel til at levere en skalerbar stump-kraft TBI til voksne zebrafisk. Den graduerede sværhedsgrad af skadesmodellen giver flere let identificerbare målinger af vellykket skade, selvom vaskulær skade er en af de nemmeste og mest fremtrædende patologier (figur 3). Den belastning af fisk, der anvendes under skaden, kan gøre denne indikator lettere eller sværere at identificere. Ved anvendelse af abfisk af…

Discussion

Undersøgelser af neurotrauma og tilhørende følgesygdomme har længe været centreret om traditionelle ikke-regenerative ^{gnavermodeller20}. Først for nylig har undersøgelser anvendt forskellige former for CNS-skade på regenerative modeller9,11,13,14,21. Selvom indsigtsfulde, disse modeller er begrænset af enten deres brug af en ska…

Materials

2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031