Ensaios de transporte nuclear em neurônios corticais de camundongos permeabilizados

Resumo

Desenvolvemos um método confiável de permeabilização seletiva da membrana plasmática de neurônios corticais primários de camundongos para análise automatizada de alto conteúdo do transporte nucleocitoplasmático neuronal.

Resumo

A interrupção do transporte nucleocitoplasmático está cada vez mais implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas. Além disso, há um reconhecimento crescente de diferenças específicas da célula na estrutura do complexo de poros nucleares, levando à necessidade de adaptar os métodos de transporte nuclear para uso em neurônios. Ensaios de células permeabilizadas, nos quais a membrana plasmática é perfurada seletivamente pela digitonina, são amplamente utilizados para estudar o transporte nuclear passivo e ativo em linhagens celulares imortalizadas, mas não foram aplicados a culturas neuronais. Em nossas tentativas iniciais, observamos a rápida perda da integridade da membrana nuclear em neurônios corticais primários de camundongos expostos a baixas concentrações de digitonina. Nossa hipótese é que as membranas nucleares neuronais podem ser exclusivamente vulneráveis à perda de suporte citoplasmático. Depois de testar várias abordagens para melhorar a estabilidade nuclear, observamos integridade nuclear ideal após lise hipotônica na presença de uma almofada concentrada de albumina de soro bovino. Os núcleos neuronais preparados por essa abordagem importam de forma confiável carga fluorescente recombinante de maneira dependente de energia, facilitando a análise da importação nuclear por microscopia de alto conteúdo com análise automatizada. Prevemos que este método será amplamente aplicável a estudos de transporte nuclear passivo e ativo em neurônios primários.

Introdução

A interrupção do transporte nucleocitoplasmático, o tráfego regulado de proteínas e RNA entre o núcleo e o citoplasma, está cada vez mais implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas (revisado recentemente¹). Nós e outros relatamos ruptura estrutural e funcional do aparelho de transporte nucleocitoplasmático em tecido post-mortem e modelos animais de esclerose lateral amiotrófica (ELA) C9orf72 e demência frontotemporal (FTD), doença de Alzheimer e doença de Huntington 2,3,4,5

Protocolo

Primeiro, o protocolo descreve a geração de culturas neuronais primárias (etapa 1) e preparação de materiais para o ensaio de transporte (etapa 2), seguido pelo próprio ensaio de transporte (etapas 3-4) e aquisição e análise de imagens (etapa 5). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) da Universidade Johns Hopkins.

1. Culturas primárias de neurônios corticais de camundongos

1. Prepare as soluções de estoque.
   1. Tampão de dissecção: Combine 50 mL de 10x HBSS, 15 mL de glicose 1 M (em dH₂O), 5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de piruvato....

Resultados

A permeabilização seletiva da membrana plasmática (Figura 1A) é a etapa mais crítica do protocolo e deve ser verificada antes de prosseguir com a análise da importação nuclear. Devido às variações entre cada preparação de cultura, uma placa de titulação inicial é rotineiramente executada para identificar as concentrações ideais específicas do lote de tampão Tris-HCl hipotônico e almofada BSA, conforme descrito na etapa 3. As células sub e superpermeabilizadas são prontamente identificadas po.......

Discussão

O protocolo detalhado acima fornece um método confiável e reprodutível para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática de neurônios corticais primários de camundongos para análise de importação nuclear. Aqui, é mostrada uma aplicação do método para análise de importação nuclear de uma carga β de importação direta (Rango), mas essa mesma abordagem pode ser usada para analisar a importação passiva e ativa de uma ampla gama de cargas fluorescentes. A permeabilização permite a manipul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 M HEPES	Gibco	15630-080
10x HBSS	Gibco	14185-052
32% paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	15714-S
96 poços placas de vidro óptico	CellVis	P96-1.5H-N
ATP sal de lítio	Millipore Sigma	11140965001
B27	Gibco	17504-044
Kit de Ensaio de Proteína Bio-Rad II	Bio-Rad	5000002
BL21(DE3) E. coli	NEB	C2527H
Soro bovino albumina fração V, choque térmico, livre de ácidos graxos	Sigma-Aldrich	3117057001
Colunas de cromatografia	Bio-Rad	7311550
Creatina quinase	Millipore Sigma	10127566001
Fosfato de creatina	Millipore Sigma	10621722001
Dextran, Texas Red, 70.000 MW	Thermo Fisher	D1864
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
E15-16 camundongos fêmeas C57BL/6J prenhes Jackson	Laboratory	000664
Excel	Microsoft	N/A
Soro bovino fetal	Hyclone	SH30070.03
Glutamax	Gibco	35050-061
Glicerol	Thermo Fisher	15514011
GTP sal de lítio	Millipore Sigma	11140957001
HALT (100x)	Thermo Fisher	78439
células HEK293T	ATCC	CRL-3216
HIS-Select HF Nickel affinity gel	Sigma-Aldrich	HO537
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H1399
ImageExpress Micro Confocal High-content Imaging System	Molecular Devices	N/A	Usado para imagens de lapso de tempo
Imidazole	Millipore	I3386
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
IPTG	Corning	46-102-RF
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
LB caldo	Grainger	31FZ62
LSM800 microscópio confocal	Zeiss	N/A	Usado para imagens de dextrana
MetaXpress Software de análise de imagem de alto conteúdo	Dispositivos moleculares	N/A
Meio neurobasal	Gibco	21103
Papaína	Worthington	LS003126
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122
Poli-D-Lisina	Sigma-Aldrich	P6407
Coquetel de inibidor de protease	Millipore Sigma	11873580001
Plasmídeo Rango (pRSET Rango2 / a1 + ligantes)	N / A	N / A	pK44, contendo N-terminal 6-His tag
SOC (caldo super ótimo com repressão catabólica) Meio	de qualidade Biológico	340-031-671
Piruvato de sódio	Gibco	11360-070
Spin-X Concentradores UF (30K MWCO)	Corning	CLS431484
Tripsina-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054

Inibidor de protease