Ressonância magnética nuclear de deslocamento puro: uma nova ferramenta para metabolômica de plantas

Resumo

Este artigo apresenta o uso de PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabólico de plantas e inclui procedimentos detalhados para preparação de amostras e registro ideal de espectros de RMN Pure Shift. Exemplos através dos quais o ganho de resolução alcançado pelo desacoplamento homonuclear permite uma compreensão mais abrangente do sistema são discutidos.

Resumo

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma das ferramentas mais poderosas utilizadas em metabolômica. Apresenta-se como um método altamente preciso e reprodutível que não apenas fornece dados quantitativos, mas também permite a identificação estrutural dos metabólitos presentes em misturas complexas.

O perfil metabólico por RMN de ¹H tem se mostrado útil no estudo de vários tipos de cenários vegetais, que incluem a avaliação das condições de cultivo, tratamentos de colheita e pós-colheita, fenotipagem metabólica, vias metabólicas, regulação gênica, identificação de biomarcadores, quimiotaxonomia, controle de qualidade, denominação de origem, entre outros. No entanto, a sobreposição de sinal do grande número de ressonâncias com multiplicidades de acoplamento J expandidas complica a análise de espectros e sua interpretação e representa uma limitação para o perfil clássico de RMN ^{de 1}H.

Na última década, novas técnicas de desacoplamento homonuclear de banda larga de RMN através das quais os sinais de múltiplos colapsos em linhas de ressonância simples - comumente chamados de métodos Pure Shift - foram desenvolvidas para superar o problema de resolução de espectros inerente aos espectros clássicos de RMN ^{de 1}H.

Aqui, é apresentado um protocolo passo a passo da preparação do extrato vegetal e o procedimento para registrar os espectros ideais de Pure Shift PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE em três matrizes vegetais diferentes - folhas de plantas de baunilha , tubérculos de batata (S. tuberosum) e groselhas do Cabo (P. peruviana). O efeito do ganho de resolução na identificação metabólica, análise de correlação e análises multivariadas, em comparação com os espectros clássicos, é discutido.

Introdução

O conjunto completo de metabólitos que compõem um organismo - substratos, intermediários e produtos finais de processos biológicos - foi cunhado em 1998 com o termo metaboloma. Sabe-se que o metaboloma está intimamente relacionado ao fenótipo, e é de particular interesse nas plantas, pois reflete a interação direta entre o genótipo e o ambiente ^1,2. Assim, a caracterização do perfil metabolômico tornou-se de suma importância nas plantas. Por meio da identificação e quantificação de biomarcadores (metabólitos-chave) e padrões metabólicos, tem^{sido possível a}

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Groselhas do cabo
   1. Coloque 100-200 g de frutas frescas em um recipiente liquidificador. Conservar a 4 °C durante 30 min e homogeneizar em seguida num misturador de laboratório.
   2. Imediatamente, transfira o suco para tubos de plástico de 50 mL, congele-os em nitrogênio líquido e liofilize até a secura por 4 a 5 dias.
   3. Moa o material liofilizado até formar um pó fino usando um moedor elétrico.
      NOTA: O manuseio do material seco precisa ser feito rapidamente porque o pó é altamente higroscópico.
   4. Pesar 1 g do material moído e adicionar 10 mL de água ultrapura. V....

Resultados

Análise de espectro de RMN
Os experimentos PSYCHE aumentam a resolução dos espectros colapsando ressonâncias acopladas em singlets²¹, o que, por sua vez, reduz a sobreposição e facilita a atribuição e a análise de dados. A RMN Pure Shift pode ser aplicada a extratos vegetais. Aqui demonstramos seu uso em três matrizes diferentes: folhas de baunilha, tubérculos de batata e frutos de Physalis peruviana . O aumento da resolução alcançado nos espectros desses extratos vege.......

Discussão

A identificação e quantificação estrutural de metabólitos são questões fundamentais na caracterização do metaboloma, dados que, quando submetidos a análises multivariadas, permitem compreender melhor o sistema biológico em estudo. A preparação da amostra e a aquisição de dados são aspectos críticos que precisam de otimização para fornecer resultados confiáveis.

Neste artigo, descrevemos e ilustramos a preparação da amostra para análise de RMN de três matrizes .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
77500 Series Freezone 4,5 litros bancada	Labconco	77500
Bruker Avance III 500 MHz equipado com uma sonda criogênica TCI Z-gradient de 5 mm	Bruker Corporation
Concentradores centrífugos refrigerados Centrivap Labconco 7310000 Series	Labconco	7310000
Óxido de deutério	Sigma-Aldrich	151882
Máquina de moer MKM6003	Bosch	MKM6003
Licuadora Blender 8011S modelo Hgb2wts3	Waring	Hgb2wts3
Metanol-d4	Sigma-Aldrich	151947