Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto
Summary
Este protocolo descreve as etapas para induzir o infarto do miocárdio em camundongos, preservando o pericárdio e seu conteúdo.
Abstract
Este protocolo mostrou que o pericárdio e seu conteúdo desempenham um papel antifibrótico essencial no modelo isquêmico de roedores (ligadura coronariana para induzir lesão miocárdica). A maioria dos modelos pré-clínicos de infarto do miocárdio requer a ruptura da integridade pericárdica com perda do meio celular homeostático. No entanto, recentemente uma metodologia foi desenvolvida por nós para induzir o infarto do miocárdio, o que minimiza os danos pericárdicos e retém a população de células imunes residentes do coração. Foi observada uma melhora da recuperação funcional cardíaca em camundongos com um espaço pericárdico intacto após a ligadura coronariana. Este método oferece uma oportunidade para estudar as respostas inflamatórias no espaço pericárdico após o infarto do miocárdio. O desenvolvimento adicional das técnicas de marcação pode ser combinado com este modelo para entender o destino e a função das células imunes pericárdicas na regulação dos mecanismos inflamatórios que impulsionam o remodelamento no coração, incluindo a fibrose.
Introduction
Até hoje, a doença cardiovascular (DCV) é reconhecida como a principal causa de morte em todo o mundo, resultando em uma significativa carga financeira e redução na qualidade de vida do paciente1. A doença arterial coronariana (DAC) é um subtipo de DCV e desempenha um papel essencial no desenvolvimento do infarto do miocárdio (IM), que é um dos principais contribuintes para a mortalidade. Por definição, o IAM resulta de lesão irreversível do tecido miocárdico devido a condições prolongadas de isquemia e hipóxia. O tecido miocárdico carece de capacidade de regeneração, de modo que as lesões são permanentes e resultam na substituição do músculo cardíaco por uma cicatriz fibrótica que pode ser inicialmente protetora, mas acaba contribuindo para o remodelamento cardíaco adverso e eventual insuficiência cardíaca2.
Embora o manejo de pacientes com DAC tenha melhorado drasticamente nas últimas décadas, a insuficiência cardíaca crônica (ICC) secundária à isquemia afeta muitos pacientes em todo o mundo. Para prevenir e gerenciar essa epidemia, é necessário entender os mecanismos subjacentes mais extensivamente e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Além disso, achados passados destacam as limitações da terapia sistêmica e a necessidade de desenvolver alternativas precisas. Dado que a investigação das sequelas moleculares do IAM em humanos é afetada pela capacidade de acessar o tecido infartado, modelos animais que recapitulam as características e o desenvolvimento do IAM humano e da ICC relacionados às DCV são indispensáveis.
Como os modelos animais ideais se assemelham muito a um distúrbio humano por características estruturais e funcionais, a etiologia da doença deve orientar sua concepção. Na DAC, é a estenose aterosclerótica crônica das artérias coronárias ou oclusão trombótica aguda. Diferentes métodos têm sido desenvolvidos e aplicados em várias espécies de animais de laboratório para induzir o estreitamento ou oclusão da artéria coronária. Tais estratégias podem ser amplamente classificadas em dois grupos: (1) manipulação mecânica de uma artéria coronária para induzir um IAM e (2) aterosclerose acelerada para facilitar o estreitamento coronariano levando a um IAM. A primeira estratégia geralmente envolve a ligadura de uma artéria coronária ou a colocação de um stent dentro da artéria. A segunda abordagem tende a depender da modificação da dieta do animal para incluir alimentos ricos em gordura / colesterol. Algumas das limitações desta última abordagem incluem a falta de controle sobre o momento e o local das oclusões coronarianas.
Em contraste, a indução cirúrgica de IAM ou isquemia em um modelo animal tem várias vantagens, como localização, tempo preciso e extensão do evento coronariano, levando a resultados mais reprodutíveis. O método mais utilizado é a ligadura cirúrgica da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE). Tais modelos recapitulam as respostas humanas à lesão isquêmica aguda, bem como a progressão para ICC3. Inicialmente desenvolvida em animais de maior porte, a cirurgia de LAD em pequenos animais, como roedores, tornou-se mais viável com os avanços da tecnologia4. Ao estabelecer tais modelos, os ratos têm sido favorecidos por várias razões, incluindo sua disponibilidade relativa, baixo gasto em habitação e sua capacidade de manipulação genética.
Modelos cirúrgicos contemporâneos de cardiopatia isquêmica utilizando oclusão LAD requerem que o pesquisador abra o pericárdio para ligar temporária ou permanentemente a artéria5. Tais estratégias resultam na ruptura do espaço pericárdico, que desempenha uma função essencialmente mecânica e lubrificante para garantir a função cardíaca adequada. Outra desvantagem da abertura do pericárdio é a perda do líquido pericárdico nativo do animal com seus diversos componentes celulares e proteicos 6,7. Em resposta, um método para induzir o IAM, mantendo o pericárdio intacto, foi desenvolvido por nós. Além de minimizar a perturbação desse ambiente homeostático, essa abordagem permite marcar e rastrear células específicas depois de causar um infarto do miocárdio. Além disso, essa abordagem representa melhor a lesão isquêmica miocárdica no ambiente humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Induzir um IAM em um pericárdio fechado em roedores é único e pode ter aplicações potencialmente significativas. O procedimento depende muito da familiaridade do cirurgião com o modelo de roedores e a anatomia cardíaca do roedor. O sucesso também depende dos cuidados dispensados durante três etapas críticas: incisão muscular intercostal e retração da costela (Passos 1.11-1.13), criação do infarto (Passo 1.17) e recuperação animal (Passos 1.22-1.24).
A toracotomia deve ser feit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture – BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
Referências
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