無傷心膜虚血性げっ歯類モデル
Summary
このプロトコルは、心膜とその内容物を保存しながらマウスに心筋梗塞を誘発するための手順を概説しています。
Abstract
このプロトコルは、心膜およびその内容物が虚血性げっ歯類モデル(心筋損傷を誘発するための冠状動脈結紮)において必須の抗線維化役割を果たすことを示している。前臨床心筋梗塞モデルの大部分は、恒常性細胞環境の喪失を伴う心膜完全性の破壊を必要とする。しかし、最近、心筋梗塞を誘発する方法論が開発され、心膜の損傷を最小限に抑え、心臓に常在する免疫細胞集団を保持しています。冠状動脈結紮後の無傷の心膜腔を有するマウスにおける改善された心機能回復が観察されている。この方法は、心筋梗塞後の心膜腔における炎症反応を研究する機会を提供する。標識技術のさらなる開発をこのモデルと組み合わせることで、線維症を含む心臓のリモデリングを促進する炎症メカニズムの調節における心膜免疫細胞の運命と機能を理解することができます。
Introduction
今日まで、心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因として認識されており、その結果、重大な経済的負担と患者の生活の質の低下が生じています1。冠動脈疾患(CAD)はCVDのサブタイプであり、死亡率の主な原因である心筋梗塞(MI)の発症に不可欠な役割を果たしています。定義上、MIは、虚血および低酸素症の長期状態による心筋組織への不可逆的な損傷から生じる。心筋組織は再生能力を欠いているため、損傷は永続的であり、心筋を線維性瘢痕に置き換え、最初は保護することができますが、最終的には有害な心臓リモデリングと最終的には心不全の一因となります2。
CAD患者の管理は過去数十年で劇的に改善されましたが、虚血に続発する慢性心不全(CHF)は世界中の多くの患者に影響を及ぼしています。この流行を予防および管理するためには、根底にあるメカニズムをより広範囲に理解し、新しい治療アプローチを開発する必要があります。さらに、過去の知見は、全身療法の限界と正確な代替案を開発する必要性を浮き彫りにしている。ヒトにおけるMIの分子後遺症が梗塞組織へのアクセス能力によって影響を受けることを調査するためには、CVDに関連するヒトMIおよびCHFの特徴と発達を再現する動物モデルが不可欠です。
理想的な動物モデルは、構造的および機能的特徴において人間の障害によく似ているため、病気の病因はそれらの概念を導くはずです。CADでは、冠状動脈の慢性アテローム性動脈硬化症狭窄または急性血栓性閉塞症です。冠状動脈の狭窄または閉塞を誘発するために、様々な種の実験動物において異なる方法が開発および適用されてきた。このような戦略は、(1)MIを誘発するための冠状動脈の機械的操作、および(2)MIにつながる冠状動脈狭窄を促進するためのアテローム性動脈硬化症の促進の2つのグループに大別することができる。最初の戦略は通常、冠状動脈の結紮または動脈内のステントの留置のいずれかを含みます。2番目のアプローチは、高脂肪/コレステロール食品を含むように動物の食事を変更することに依存する傾向があります。この後者のアプローチの限界のいくつかには、冠状動脈閉塞のタイミングおよび部位に対する制御の欠如が含まれる。
対照的に、動物モデルにおけるMIまたは虚血の外科的誘導には、冠状動脈イベントの位置、正確なタイミング、および程度などのいくつかの利点があり、より再現性の高い結果につながります。最も広く使用されている方法は、左前下行冠状動脈(LAD)の外科的結紮です。このようなモデルは、急性虚血性損傷に対するヒトの反応、ならびにCHF3への進行を再現する。当初は大型動物で開発されましたが、げっ歯類などの小動物に対するLAD手術は、技術の進歩により実現可能になりました4。このようなモデルを確立する際に、マウスは、その相対的な可用性、住居での低コスト、遺伝子操作の能力など、さまざまな理由で支持されてきました。
LAD閉塞を用いた虚血性心疾患の現代の外科モデルでは、研究者が心膜を開いて動脈を一時的または恒久的に結紮する必要があります5。そのような戦略は、適切な心機能を確保するために本質的に機械的および潤滑機能を担う心膜腔の破壊をもたらす。心膜を開くことの別の欠点は、その様々な細胞およびタンパク質成分を有する動物の本来の心膜液を失うことである6,7。そこで、心膜を無傷に保ちながらMIを誘導する方法を開発した。この恒常性環境の摂動を最小限に抑えることに加えて、このアプローチは、MIを引き起こした後に特定の細胞にタグを付けて追跡することを可能にする。さらに、このアプローチは、人間の設定における心筋虚血性損傷をよりよく表します。
Protocol
Representative Results
Discussion
げっ歯類の閉じた心膜にMIを誘導することは独特であり、潜在的に重要な用途を持つ可能性があります。この手順は、げっ歯類モデルとげっ歯類の心臓解剖学に関する外科医の精通度に大きく依存しています。成功は、肋間筋切開と肋骨の収縮(ステップ1.11-1.13)、梗塞の作成(ステップ1.17)、動物の回復(ステップ1.22-1.24)の3つの重要なステップで与えられるケアにも依存します。
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture – BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), (2018).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
- Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
- Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
- Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
- Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
- Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
- Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
- Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).
