הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

Summary

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

Abstract

אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) מספקים כלי רב עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה. רישומי מערך מרובה אלקטרודות (MEA) הם אמצעי להקליט פוטנציאלים של שדות חשמליים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב ולנתח את פעילות הרשת לאורך זמן. בעבר הוכח כי נוכחותם של hiPSC-A המובחנים באמצעות טכניקות לקידום פנוטיפ אסטרוציטים של חוט השדרה שיפרה את ההבשלה ואת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של נוירונים מוטוריים hiPSC-motor (MN) ספציפיים לחוט השדרה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית ללא hiPSC-A או בנוכחות אסטרוציטים מכרסמים. מתוארת כאן שיטה לתרבית משותפת של חוט השדרה hiPSC-A עם hiPSC-MN ולהקליט פעילות אלקטרופיזיולוגית באמצעות רישומי MEA. בעוד שפרוטוקולי ההתמיינות המתוארים כאן הם ייחודיים לאסטרוציטים ונוירונים ספציפיים לאזור חוט השדרה, פלטפורמת הרבייה המשותפת יכולה להיות מיושמת על אסטרוציטים ונוירונים המובחנים בטכניקות ספציפיות לגורלות אחרים, כולל hiPSC-A קליפת המוח ו- hiPSC-N. פרוטוקולים אלה נועדו לספק בדיקה אלקטרופיזיולוגית כדי ליידע על אינטראקציות גליה-נוירון ולספק פלטפורמה לבדיקת תרופות עם פוטנציאל טיפולי ב- ALS.

Introduction

אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) הם כלים רבי עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה ומספקים פרדיגמה תרגומית לאסטרטגיות גילוי תרופות¹. חוקרים הוכיחו כי התרבית המשותפת של hiPSC-A עם hiPSC-N משפרת את ההבשלה המורפולוגית, המולקולרית, האלקטרופיזיולוגית והפרמקולוגית של שני סוגי התאים, ויוצרת רשתות עצביות מורכבות ואינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים הדומות לעמיתיהם in vivo ^2,3. ניסויים דומים בתרבית משותפת יכולים לשחזר סימני היכר של פתולוגיה של ALS כגון רעילות עצבית בתיווך אסטרוציטים ^4,5 ורגישות יתר עצבית⁶. בנוסף, עם התקדמות בפרוטוקולי התמיינות, ניתן להתמיין לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) לתת-סוגים עצביים ספציפיים לאזור, כולל hiPSC-A בקליפת המוח ובחוט השדרה ו-hiPSC-N ^7,8. אסטרטגיות אלה מספקות את הפוטנציאל למידול פתולוגיה של נוירונים מוטוריים בקליפת המוח ובעמוד השדרה ב- ALS, כמו גם את ההשפעה האסטרוציטית על שניהם. עם זאת, זה דורש כי יש בדיקה פונקציונלית לשחזור כדי לקבוע השפעות אלה.

לאחרונה הוכח כי רישום מערך רב-אלקטרודות (MEA) מתאים במיוחד לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תרביות משותפות נוירון-אסטרוציטים². בניגוד לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים חד-תאיים, מערכי אלקטרודות בצפיפות גבוהה אלה רושמים באופן פסיבי פוטנציאלים של שדות חוץ-תאיים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב מבלי להפריע לתנאי התרבית ולשמור על שלמות קרום התא. פלטפורמות אלה שימושיות במיוחד לתיעוד הפעילות הסלולרית והרשתית של תרביות לאורך זמן ובתגובה למניפולציה פרמקולוגית. לבסוף, כאשר נוכחות אסטרוציטים היא משתנה תרבית, רישומי MEA יכולים לספק תובנות תפקודיות לגבי אינטראקציות דו-כיווניות בין אסטרוציטים^{לנוירונים 2,9}.

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי להבחנה של hiPSC לחוט השדרה hiPSC-A ונוירונים מוטוריים hiPSC (MN) שאומת בעבר². פרוטוקול התמיינות hiPSC-A של חוט השדרה מביא באופן עקבי לתרביות אסטרוציטים, שהן חיוביות עבור חלבון קושר סידן S100 B (S100β), חלבון חומצי גליה פיברילרי (GFAP) והומיאובוקס B4 (HOXB4) בעד 80%, 50% ו-90% מהתאים, בהתאמה, מה שמצביע על מפרט גליה וחוט שדרה מבשיל ^2,10 . פרוטוקול התמיינות hiPSC-MN מייצר נוירונים חיוביים >90% עבור אצטילטרנספראז כולין (ChAT), המרמז על זהות נוירון אלפא-מוטורי בוגר². בנוסף, הפרוטוקול מתאר טכניקות ליצירת תרביות משותפות של hiPSC-A/MN שהוכחו בעבר כגורמות לנוירונים בעלי מורכבות מורפולוגית משופרת על ידי ניתוח שול ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בהשוואה לתרביות עצביות ללא אסטרוציטים או עם אסטרוציטים מכרסמים². בעוד תיאורים אלה ספציפיים לחוט השדרה hiPSC-A ו- hiPSC-N, יתרון ייחודי הוא שניתן לתרגם את התרבית העצמאית הראשונית של אסטרוציטים ונוירונים ואחריה צעדים לתרבות משותפת בנקודות זמן מאוחרות יותר כדי לחקור את ההשפעות של אינטראקציות נוירון-אסטרוציטים מאזורים ספציפיים אחרים, כמו גם תאים ספציפיים למחלה ^7,8 . לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל תרביות אלה על לוחות MEA כך שניתן יהיה לחקור את הפעילות הפונקציונלית כגורם של הרכב תרבית משותפת לאורך זמן עם היכולת להשפיע על הרכב התא כמו גם על תנאי התרבית.

מטרת פרוטוקולים אלה היא לספק בדיקה פונקציונלית לחקר אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים, לבחון שינויים ספציפיים למחלה ולבחון תרופות בעלות פוטנציאל טיפולי בתחום ה-ALS. הוראות וידאו מסופקות עבור השלבים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה.

Protocol

1. הכנת מדיה לתרבית תאים הכן את המדיה הבודדת של תרבית תאים באמצעות ההרכבים המוזכרים בטבלה 1. יש לערבב ולסנן סטרילית את המדיה בבקבוקים מסוננים במינון 500 מ”ל, ולאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. 2. שמירה והעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המוש…

Representative Results

פרוטוקול דפוס חוט השדרה ליצירת hiPSC-MN וחוט השדרה hiPSC-A מתואר באיור 1. בפרוטוקול הזה, hiPSCs מתוחזקים ומועברים כמושבות לא מתמזגות (איור 2A). נוירוגנזה מתחילה (אינדוקציה עצבית) באמצעות עיכוב SMAD כפול על ידי תוספת של LDN193189 ו- SB431542, השבתת החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP) ומסל…

Discussion

עד כה, שיטות מבוססות hiPSC ו-MEA לרישומים אלקטרופיזיולוגיים של תרביות משותפות של אסטרוציטים-נוירונים מצאו יישום מוגבל בתחום ALS⁶ ועדיין לא בפלטפורמות אנושיות לחלוטין, בניגוד לשימוש הנפוץ יותר שלהן למידול חוץ גופי של אפילפסיה⁹. עם זאת, לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לענ?…

Materials

10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix – Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B – B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N – N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film – Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease – Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp