Мезенхимальная регуляция стволовых клеток макрофагального фагоцитоза; Количественное и визуализация
Summary
Здесь представлен протокол для количественной оценки и получения динамических изображений мезенхимальных стволовых клеток (MSC), опосредованной регуляцией фагоцитоза макрофагов (MΦ) частиц неопсонизированных дрожжей (zymosan), которые конъюгируются с pH-чувствительной флуоресцентной молекулой.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) традиционно изучались на предмет их регенеративных свойств, но в последнее время их иммунорегуляторные характеристики были на переднем крае. Они взаимодействуют и регулируют активность иммунных клеток. В центре внимания данного исследования находится МСК-регуляция фагоцитарной активности макрофагов. Фагоцитоз макрофагов (MΦ) является важной частью врожденного ответа иммунной системы на инфекцию, и механизмы, с помощью которых MSC модулируют этот ответ, активно исследуются. Здесь представлен метод изучения фагоцитоза MΦ неопсонизированных частиц зимозана, конъюгированных с pH-чувствительной флуоресцентной молекулой в совместной культуре с MSC. По мере увеличения фагоцитарной активности и попадания меченых частиц зимозана в кислую среду фаголизосомы интенсивность флуоресценции рН-чувствительной молекулы увеличивается. При соответствующих длинах волн возбуждения и излучения фагоцитарную активность измеряют с помощью флуоресцентного спектрофотометра, а кинетические данные представляют в виде изменений относительных флуоресцентных единиц в течение 70-минутного периода. Чтобы поддержать эти количественные данные, изменение фагоцитарной активности визуализируется с помощью динамической визуализации. Результаты с использованием этого метода показывают, что при совместной культуре MSC усиливают фагоцитоз MΦ неопсонизированного зимозана как наивного, так и IFN-γ обработанного MΦ. Эти данные дополняют текущие знания о регуляции MSC врожденной иммунной системы. Этот метод может быть применен в будущих исследованиях, чтобы полностью очертить лежащие в основе клеточные и молекулярные механизмы.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) являются клетками-прародителем, которые дают начало клеткам соединительной ткани. MSC присутствуют в тканях взрослых млекопитающих и могут быть выделены из костного мозга1. Благодаря своим иммуномодулирующим свойствам, эти клетки широко изучены2. Ранние исследования были сосредоточены на регуляции MSC Т-клеток3,4,5,6, но в последнее время их регуляция клеток макрофагов (MΦ), основного клеточного компонента врожденного иммунитета, получила повышенное внимание7,8,9,10,11,12,13,14 . Важность взаимодействия MSC-MΦ в лечении воспалительных заболеваний подчеркивается тем фактом, что истощение моноцитов/макрофагов отменяет терапевтические эффекты MSC на животных моделях8. Здесь в центре внимания находится клеточно-контактное взаимодействие MSC с MΦ. MSC обладают способностью регулировать фенотип MΦ, способствуя переходу от воспалительных к противовоспалительным реакциям, что приводит к деятельности по восстановлениютканей 8,9,10,11,и многое было сделано для демонстрации этих регуляторных механизмов. При других обстоятельствах MSC может поддерживать или усугублять воспалительную реакцию, вызванную MΦ12,13 и усиливать фагоцитарную активность MΦ14,15. Однако существует критическая нехватка существующих данных, которые идентифицируют механизмы, с помощью которых MSC и условия, при которых MSC регулируют фагоцитарную активность MΦ.
MΦ имеют семейства рецепторов, которые распознают либо опсонизированные (покрытые антителами или комплементом), либо неопсонизированные патогены, приводящие к фагоцитозу16. Активация и активность последних изучены менее хорошо17. В невоспалительной среде in vitro MSC усиливают MΦ фагоцитоз неопсонизированных патогенов13. Однако распознавание неопсонизированных патогенов MΦ может быть уменьшено после воздействия воспалительной среды, продуцируемой лимфоцитами во время адаптивного иммунного ответа. IFN-γ, высвобождаемая естественными клетками-киллерами и эффекторными лимфоцитами, оказывает ингибирующее действие на фагоцитоз MΦ неопсонизированных частиц18. Разработана модель кокультуры для изучения механизмов регуляции MSC прямого контакта MΦ фагоцитоза. Цель эксперимента, представленного здесь, состоит в том, чтобы определить, регулируют ли MSC фагоцитоз MΦ неопсонизированных патогенов после того, как MΦ подверглись воздействию IFN-γ(рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ фагоцитоза с использованием биочастиц, конъюгированных с рН-чувствительным красителем, является относительно новым инструментом, который оказался преимуществом перед традиционными флуоресцентно мечеными частицами12,19,20. С тр?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана механизмом NSF Major Research Instrument в рамках грантов 1626093 и 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
Referências
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
