Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro
Summary
Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.
Abstract
Las células dendríticas (DC) son importantes células presentadoras de antígenos que conectan las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los DC son heterogéneos y se pueden dividir en DC convencionales (cDC) y DC plasmocitoides (pDC). Los cDC se especializan en presentar antígenos y activar células T naïve. Por otro lado, los pDC pueden producir grandes cantidades de interferones tipo I (IFN-I) durante la infección viral. La especificación de los DC ocurre en una etapa temprana de los progenitores de DC en la médula ósea (BM) y se define por una red de factores de transcripción (TF). Por ejemplo, los cDC expresan altamente ID2, mientras que los pDC expresan altamente E2-2. Dado que se están identificando cada vez más subconjuntos de DC, existe un creciente interés en comprender los TF específicos que controlan el desarrollo de DC. Aquí, establecemos un método para detectar TF críticos para la diferenciación de DC in vitro mediante la entrega de lentivirus portadores de ARN de horquilla corta (shRNA) en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPC). Después de la selección y diferenciación in vitro , el potencial cDC y pDC de las líneas celulares de derribo estable se analiza mediante citometría de flujo. Este enfoque proporciona una plataforma para identificar genes que potencialmente gobiernan los destinos de DC de progenitores in vitro.
Introduction
Los DC son reguladores clave de la inmunidad innata y adaptativa1. Los DC se clasifican principalmente en dos poblaciones funcionalmente distintas, a saber, pDC y CDC. Además, los cDC comprenden dos subconjuntos, a saber, los cDC de tipo I y tipo II o cDC1 y cDC2, respectivamente2. Los pDC, que expresan BST2, Siglec-H y niveles intermedios de CD11c en ratones3,4, son las células que pueden secretar grandes cantidades de IFN-I durante la inflamación y la infección viral5. Debido a su robusta capacidad de producción de IFN-I, también se sospecha que desempeñan un papel clave en la progresión de enfermedades autoinmunes, incluido el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los cDC1s, definidos por la expresión superficial de XCR1, CD8a, CLEC9A y CD103 en ratones7, están especializados en la activación y polarización de células T citotóxicas CD8+ (CTL) a través de la presentación cruzada de antígenos, iniciando así la inmunidad tipo I en respuesta a patógenos intracelulares y cáncer8,9. Por otro lado, los cDC2s, que expresan CD11b y CD172α (también conocidos como Sirpα) tanto en humanos como en ratones, pueden activar las células T CD4+ y promover la respuesta inmune tipo II frente a alérgenos y parásitos10, así como modular la inmunidad tipo III tras el reconocimiento extracelular de bacterias y microbiota11,12.
La diversificación de los DC está determinada por un grupo de TF a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en el BM. E2-2 (codificado por Tcf4) es un regulador maestro para la diferenciación y función de los pDC13,14. Por el contrario, el inhibidor de la unión al ADN 2 (ID2) impulsa la especificación de cDC e inhibe el desarrollo de pDC a través del bloqueo de la actividad de la proteína E15. Además, el desarrollo de cDC1 requiere IRF8 y BATF3, mientras que la diferenciación de cDC2 depende en gran medida de IRF416. Trabajos recientes han explorado la heterogeneidad de los pDCs17 y cDCs y su regulación transcripcional18. Debido a la complejidad de la red de CC, existe una necesidad insatisfecha de establecer una plataforma para identificar otros TF que controlen el desarrollo y la funcionalidad de los CONTROLADORES.
Aquí, utilizamos un iHSPC que se generó al expresar la translocación nuclear regulada por estrógenos de Hoxb8 en células BM (también conocidas como células Hoxb8-FL)19. Los iHSPC pueden proliferar y permanecer en una etapa indiferenciada en presencia de β-estradiol y ligando Flt3 (FL), mientras que comienzan a diferenciarse en diferentes tipos de DC en presencia de FL al retirar β-estradiol19. Sobre la base de esta característica, podemos derribar genes de interés en la etapa progenitora, seguido de examinar el efecto sobre la diferenciación in vitro de pDC y cDC. Por lo tanto, este método es una herramienta poderosa para descubrir los genes que regulan el desarrollo y la función de los DC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los vectores de ARNt sh basados en lentivirus se utilizan a menudo para el silenciamiento de genes por transducción viral en las células y permiten una integración estable en el genoma del huésped. Sin embargo, es necesario considerar varias eficiencias de transducción en diferentes tipos de células, y se han adoptado varios enfoques para superar este problema.
El polibreno es un polímero policatiónico que puede neutralizar las cargas en la membrana celular, mejorando así la unión d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo técnico del Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos a la Instalación Central Nacional de ARNi (Academia Sinica, Taiwán) por proporcionar lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 y MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
Referências
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