이중 불소공포증 비율 현미경 검사를 사용하여 매크로피노좀의 pH, 레독스 화학 및 분해 능력 측정
Summary
우리는 살아있는 세포에 있는 개별 적인 macropinosomes에 있는 pH, 산화 사건 및 단백질 소화를 측정하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이중 불소 경 미세 검사법과 인구 기반 기술에 비해 제공하는 이점에 중점을 둡니까.
Abstract
최근 몇 년 동안, 매크로 피노세포증의 분야는 급속하게 성장하고있다. Macropinocytosis는 선천적인 면역 세포가 유기체 항상성 및 면역을 유지하는 중앙 기계장치로 나타났습니다. 동시에 동종 요법 역할과는 달리 암 및 바이러스 감염을 포함한 다양한 병리를 유발할 수도 있습니다. 다른 내분세포증 모드와 달리, 매크로피노좀의 성숙을 연구하기 위해 개발된 도구는 여전히 저개발 상태입니다. 여기서 이 프로토콜은 조기 및 성숙한 매크로피노좀의 루멘 내에서 레독스 환경을 연구하기 위한 새로 개발된 도구에 대해 설명합니다. pH를 평가하는 비메트릭 형광 현미경 검사를 사용하기 위한 방법론, 반응성 산소 종의 생산 및 살아있는 세포에서 개별 거형의 루멘 내의 분해 용량이 설명되어 있습니다. 단일 세포기관 측정은 인구 기반 접근법으로 종종 손실되는 괄면적 이질성을 드러내는 이점을 제공합니다. 프로브 선택, 계측, 교정 및 단일 세포 대 인구 기반 방법을 포함한 이중 형광비율 현미경검사법의 기본 원리에 중점을 둡히 배치됩니다.
Introduction
Macropinocytosis는 거시화1,2에게불린 막 결합 세포질 세포체로 세포외 유체의 다량의 uptake를 말합니다. 아메바 디티오스텔라늄 spp와같은 자유 생활 단세포 유기체에 의해 수행되는 매우 보존된 과정입니다. 3,뿐만 아니라 안토조안4 및 메타 조아2. 대부분의 세포에서, macropinocytosis는 유도된 사건입니다. 세포 표면 수용체의 결찰은 주름이라고 불리는 액틴 구동 플라즈마 멤브레인 확장의 돌출을 유도합니다. 일부 제대로 이해 메커니즘에 의해, 그 주름의 일부, 거시형을 형성하기 위해 자신의 말단 팁에서 밀봉 (비록이 방법 종이의 범위를 넘어, 매크로 피노 세포증의 역학에 대한 자세한 검토를 위해, 참조참조 를참조하시기 바랍니다1,2,5,6,7). 거시피노세포증을 유도하는 세포외 자극은 가장 자주 용해성장인5,8이다. 따라서, 거시적인 세포질 이벤트는 세포가 성장을 용이하게 하기 위하여 유용한 대사산물을 파생할 수 있는 세포외 물질의 bolus의 섭취를 허용합니다. 불행히도, 영양 전달을 위한 이 통로는 또한 병리학을 이끌어 내수 있습니다. 특정 암세포는 연속또는 구성적인 거대 세포증귀착되는 돌연변이를 항구합니다. 영양소의 지속적인 전달은 암세포의 통제되지 않는 증식을 용이하게 하고 특히 공격적인 종양9,10,11,12,13에연결되었다. 유사하게, 바이러스는 거혈구 세포에 접근하기 위하여 macropinocytosis를 유도할 수 있고, 이에 의해 바이러스성 병리학을 구동할 수 있다14.
Macropinocytosis는 또한 병원체에 대한 면역의 유지 에 기능. 대식세포 및 수지상 세포와 같은 특정 선천성 면역 세포는 대식세포6,15,16을통해 세포외 유체의 구성적이고 공격적인샘플링에종사한다. 이 매크로 피노세포증 의 모드는 믿을 수 없을 만큼 활성화되어 있으며, 단일 수지상 세포세포는 매시간17일마다자체 체중에 상응하는 세포외 유체의 부피로 스스로를 자극할 수 있다. 이 구성 샘플링에도 불구하고, 대식세포 및 수지상 세포는 종양 세포처럼 통제할 수 없는 복제되지 않으며, 대신, 정보를 추출하여 잠재적인 위협에 대해 알리기 위해 세포외 물질을 처리하는 것처럼 보입니다. i) 병원체 인식 수용체 및 ii) 적응형면역계의세포별 스크리닝을 위한 주요 조직적합성 분자에 적재될 수 있는 아미노산의 짧은 스트레칭으로추출된다. 병원균이 면역 세포에 의한 정보 처리를 위해 이 통로를 전복하는지 여부는 현재 불분명합니다.
면역 및 항상성의 유지 보수와 다른 보다 일반적으로 연구된 내분비증 모드와는 대조적으로 거시피노세포증에 대한 이러한 잘 정의되고 중요한 역할에도 불구하고, 매크로 피노좀의 내부 (발광) 작동의 거의 알려져 있다. macropinosomes의 발광 생화학을 연구하는 표준화된 프로토콜 및 도구를 개발하는 것은 우리가 그들의 독특한 생물학을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 약물 전달20을포함하여 새로운 치료 전략에 활용할 수 있는 통찰력을 제공할 것입니다. 이 방법 원고는 단일 세포기관 수준에서, 매크로 피노좀의 발광 생화학의 다양한 양상에서 해부하기 위해 최근에 개발 된 도구에 초점을 맞출 것이다.
형광은 i) 관심의 구획에 우선적으로 분할하는 경우 세포기관의 특정 생화학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다 및 ii) 그들은 관심의 매개 변수에 대한 응답으로 스펙트럼 변화를 겪고. 예를 들어, pH의 경우, 아크리딘 오렌지, 크레실 바이올렛 및 LysoTracker 염료와 같은 형광 약한 염기는 산성 세포에서 우대적으로 축적된다. 따라서, 그들의 상대적 강도는 표지된 세포기관이 산성이라는 거친 표시이다. 다른 pH 반응형 형광류는 형광, pHrodo 및 cypHer5e와 같은, 양성자에 결합시 스펙트럼 변화를 겪습니다(도 1A–C). 따라서 pH에 민감한 형광의 형광 방출을 변경하면 pH의 유용한 근사치를 제공할 수 있습니다. 단 하나 형광의 사용은, 그러나, 불이익의 수를 제시합니다. 예를 들어, 초점 평면의 변화, 광표백, 개별 소기관의 부피에 의한 변화,거형(21)의일반적인 발생은 단일 형광구의 형광 강도에 변화를 유도할 수 있으며, 이는22에대해 쉽게 수정할 수 없다. 단일 파장 평가는 산성 구획을 시각화하는 데 유용하지만 순전히 질적입니다.
보다 정량적인 접근법은 관심 있는 세포에 대한 참조 형광소와 함께 매개 변수에 민감한 형광소를 표적으로 하는 것입니다. 참고형 형광소는 세포기관 내의 생화학적 변화에 이상적으로 민감하지않으며(도 1D–F)따라서 초점 평면, 유기체 부피 및 어느 정도, 광표백23의변화를 보정하는 데 사용될 수 있다. 이중 형광경형광이라고 하는 이 접근법을 이용하여, 기준형광소에 대한 파라미터 에 민감한 형광방출의 비율을 생성함으로써 보정이 이루어질 수 있다.
여기서, 프로토콜은 매크로피노좀 내의 pH, 산화 이벤트 및 단백질 분해를 측정하기 위해 이중 플루오로포어 비율 이미징의 원리를 활용하게 될 것이다. 각각의 경우, 관심의 매개 변수및 기준 형광호에 민감한 불소호레가 선택됩니다. 특히 거시피노솜을 대상으로 하기 위해, 70kDa dextran에 공동으로 결합되며, 이는대거피노좀(24)에우선적으로 통합된다. 모든 검사는 Raw264.7 세포에서 수행되지만 다른 세포 유형에 적응할 수 있습니다. 가능하면 형광 비율이 참조 곡선에 대해 보정되어 절대 값을 얻습니다. 중요한 것은, 모든 측정은 매크로 피노좀의 발광 환경의 동적 및 정량적 평가를 위해 살아있는 세포에서 수행될 것이다.
pH 에 민감한 형광을 선택할 때, 고려 사항의 숫자를 무게해야합니다. 첫 번째는 프로브가 가장 민감할 pH 값의 범위를 나타내는 플루오로포어의 pK입니다. 형성 직후, 매크로피노종의 pH가 세포외 배지(~pH 7.2)에 가까우며, 후기 내분 및 리소좀(~pH 5.0)과의 상호작용을 통해 점진적으로 산산화될 것이고, 그 범위 내에서 민감한pK를 가진 프로브(그림2C)를선택해야 한다고 가정한다. 6.4의 pK를 가지고 있는 형광형광체는 그 범위 내에서 최적으로 민감합니다. 그것은 phagosomes와 같은 그밖 유사한 세포기관을 측정하기 위하여 광범위하게 이용되고, 이 원고22에서선택의 불소로 피오로폰이 될 것입니다22,25. 참고형 플루오로포레로서, 테트라메틸lrhodamine이 사용되며, 이는 pH(도1E)에민감하지 않습니다. pHrodo 및 cypHer5e와 같은 다른 형광은 형광체의 스펙트럼 특성이 다른 실험 변수와 일치하는 형광체로 대체 될 수 있습니다. pHrodo 및 cypHer5e에 대한 일부 제안된 참조 형광은 도 1에도시된다.
두 번째 고려 사항은 두 형광이 특히 매크로 피노좀을 대상으로하는 방법입니다. 약 7nm의 유체역학적 반경을 가지는 70kDa 크기의 Dextran은 세포에 특별히 붙어 있지 않고 거시피노솜에 통합되지 않지만 클래트린 코팅 구덩이 나 카볼라에 통합되지 않으므로 거시피노솜(그림 2A 및 도 3A,B)16, 24,26,26을표시한다. 이 프로토콜에서, 형광표지 70 kDa dextran 및 tetramethylrhodamine (TMR)-표지70 kDa dextran는 pH 에민감한 및 참조 프로브로 각각 사용됩니다.
선천성 면역 세포에서, macropinocytosis 및 phagocytosis는 적응성 면역 반응의 세포에 처리 및 후속 프리젠 테이션을 위한 외인성 물질의 내재화를 위한 2개의 주요 경로를나타낸다(27). 외향성 및 거형의 루멘의 레독스 화학에 대한 신중하고 조정된 제어는 외인성 물질의 컨텍스트 별 처리에 매우 중요합니다. 아마도 phagosomes에서 산화 이벤트의 가장 잘 연구 된 레귤레이터는 NADPH 산화제, phagosomes의 lumen 내에서 반응성 산소 종 (ROS)의 대량을 생산하는 큰 다중 서브 유닛복합체이다 28. 실제로, 그 활동은 식도제 29,30내의 적절한 항원 처리의 중심이다. 그러나, 거형 엽막에 NADPH 산화제의 활동은 탐구되지 않았습니다.
이 프로토콜에서, H2DCFDA succinimidyl 에스테르는 매크로 피노솜 내의 산화 이벤트를 측정하는 데 사용됩니다. 이것은 형광체의 변형 된 형태입니다 (2′,7′-디클로로디 하이드로 플루오레세신 diacetate), 이는 감소 된 형태로 최소한의 형광이다. 산화 시 형광 방출이 크게 증가합니다. 그러나 H2DCFDA의 중요한 주의 사항을 주목할 필요가 있습니다 – 형광형형에 기초하기 때문에, 그 형광은 또한 산성 구획에 담금질하고,실험(28)을설계할 때 이 변수를 제어하기 위하여 주의해야 한다. PH 측정 접근법과 유사하게, H2DCFDA succinimidyl 에스테르는 70 kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran에 공동으로 부착될 것이며, 참고플루오로포어(그림3A)로사용될 것이다.
형광 성 배 소안은 거형 내의 단백질 분해를 측정하는 데 사용됩니다. 여기에 사용되는 ovalbumin는 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL 염료로 조밀하게 표시되어 있습니다. 소화 시, 강하게 형광염염 표지 펩티드가 해방됩니다. ovalbumin은 쉽게 70 kDa dextran에 컨쥬게이트 할 수 없기 때문에, TMR 라벨 70 kDa dextran 및 유체 상 ovalbumin을 가진 세포는 공동 배양될 것입니다. TMR 신호는 이미징 후 분석 중에 거시형 마스크를 생성하는 데 사용되며 소화된 ovalbumin에서 해방된 신호는 마스크 내에서 측정됩니다(도3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
대식세포, 섬유아세포, 심지어 Dictyostelium spp에서 대식세포 섭취의 저처리량 측정과 높은 처리량 측정을 위한 프로토콜의 수가 많지만. 3,7,31,32,33,이러한 동적 구획의 발광 생화학을 측정하기 위한 시도는 거의 이루어지지 않았습니다. 이는 다른 내식 구획을 피하면서 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 캘거리 대학의 지원에 감사드립니다. 또한 시약, 장비 및 유용한 토론에 대한 로빈 예이츠 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
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