Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии
Summary
Описаны протоколы измерения рН, окислительных событий и переваривания белка в отдельных макропиносомах живых клеток. Акцент делается на двойной флуорофорной логометрической микроскопии и преимуществах, которые она предлагает по сравнению с популяционными методами.
Abstract
В последние годы область макропиноцитоза стремительно росла. Макропиноцитоз возник как центральный механизм, с помощью которого врожденные иммунные клетки поддерживают гомеостаз организма и иммунитет. Одновременно и в отличие от своей гомеостатической роли, он также может управлять различными патологиями, включая рак и вирусные инфекции. В отличие от других способов эндоцитоза, средства, разработанные для изучения созревания макропиносом, остаются недостаточно развитыми. Здесь протокол описывает недавно разработанные инструменты для изучения окислительно-восстановительной среды в просвете ранних и созревающих макропиносом. Описаны методологии использования ратиометрической флуоресцентной микроскопии при оценке рН, производства активных форм кислорода и деградативной способности в просвете отдельных макропиносом живых клеток. Измерения одной органеллы дают преимущество выявления пространственно-временной гетерогенности, которая часто теряется при популяционных подходах. Акцент делается на основных принципах двойной флуорофорной ратиометрической микроскопии, включая выбор зонда, приборы, калибровку и одноклеточные и популяционные методы.
Introduction
Макропиноцитоз относится к поглощению большого количества внеклеточной жидкости в мембранно-связанные цитоплазматические органеллы, называемые макропиносомами1,2. Это высоко консервативный процесс, выполняемый свободноживущие одноклеточными организмами, такими как амеба Dictyostelium spp. 3, а также антозоаны4 и метазоаны2. В большинстве клеток макропиноцитоз является индуцированным событием. Перевязка рецепторов клеточной поверхности индуцирует протрузию актин-управляемых расширений плазматической мембраны, называемых оборками. Часть этих оборок, по какому-то плохо изученному механизму, запечатывается на их дистальных кончиках с образованием макропиносом (хотя за рамками данного метода статьи, для подробных обзоров по механике макропиноцитоза, пожалуйста, обратитесь к ссылкам1,2,5,6,7). Внеклеточный раздражитель, индуцируя макропиноцитоз, чаще всего является растворимым фактором роста5,8. Соответственно, макропиноцитарный случай позволяет проглотить болюс внеклеточного материала, из которого клетка может получать полезные метаболиты для облегчения роста. К сожалению, этот путь доставки питательных веществ также может привести к патологии. Некоторые раковые клетки содержат мутации, которые приводят к непрерывному или конститутивному макропиноцитозу. Непрерывная доставка питательных веществ способствует неконтролируемой пролиферации раковых клеток и связана с особенно агрессивными опухолями9,10,11,12,13. Аналогичным образом, вирусы могут индуцировать макропиноцитоз, чтобы получить доступ к клеткам-хозяевам, тем самым приводя к вирусной патологии14.
Макропиноцитоз также функционирует в поддержании иммунитета к патогенам. Некоторые врожденные иммунные клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, участвуют в конститутивном и агрессивном отборе проб внеклеточной жидкости через макропиноцитоз6,15,16. Этот режим макропиноцитоза невероятно активен, и одна дендритная клетка может нагрубать себя объемом внеклеточной жидкости, эквивалентным ее собственному весу каждый час17. Несмотря на этот конститутивный отбор проб, макрофаги и дендритные клетки не реплицируются бесконтрольно, как это делают опухолевые клетки, вместо этого они, по-видимому, обрабатывают внеклеточный материал таким образом, что информация может быть извлечена для информирования о наличии или даже отсутствии потенциальных угроз. Информация извлекается в виде i) патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, которые могут быть прочитаны внутриклеточными рецепторами распознавания патогенов и ii) коротких участков аминокислот, которые могут быть загружены на основные молекулы гистосовместимости для скрининга клетками адаптивной иммунной системы16,18,19. Подрывают ли патогены этот путь для обработки информации иммунными клетками, в настоящее время неясно.
Несмотря на эти четко определенные и критические роли макропиноцитоза как в поддержании иммунитета, так и в гомеостазе и в отличие от других более часто изучаемых способов эндоцитоза, мало что известно о внутренней (люминальной) работе макропиносом. Разработка стандартизированных протоколов и инструментов для изучения люминальной биохимии макропиносом не только поможет нам лучше понять их уникальную биологию, но и обеспечит понимание, которое может быть использовано для новых терапевтических стратегий, включая доставку лекарств20. Эта рукопись метода будет сосредоточена на недавно разработанных инструментах для препарирования на уровне одной органеллы различных аспектов люминальной биохимии макропиносом.
Флуорофоры могут быть использованы для измерения специфических биохимий органелл, если i) они разделяются преимущественно в интересующий их отсек и/или ii) претерпевают спектральные изменения в ответ на интересующий параметр. Например, в случае рН флуоресцентные слабые основания, такие как акридин оранжевый, крезиловый фиолетовый и красители LysoTracker, накапливаются преимущественно в кислых органеллах. Поэтому их относительная интенсивность является грубым признаком того, что меченая органелла является кислой. Другие рН-чувствительные флуорофоры, такие как флуоресцеин, pHrodo и cypHer5e, претерпевают спектральные изменения при связывании с протонами(рисунок 1A–C). Таким образом, изменения флуоресцентного излучения pH-чувствительных флуорофоров могут обеспечить полезное приближение pH. Использование одиночных флуорофоров, однако, представляет ряд недостатков. Например, изменения в фокальной плоскости, фотоотбеливание и изменения объема отдельных органелл, часто встречающиеся в макропиносомах21,могут вызывать изменения интенсивности флуоресценции одиночных флуорофоров, и это не может быть легко исправлено для22. Поэтому одноволновые оценки, хотя и полезны для визуализации кислотных компартментов, являются чисто качественными.
Более количественный подход заключается в нацеливание на чувствительный к параметрам флуорофор вместе с эталонным флуорофором на органеллу, которая представляет интерес. Эталонный флуорофор идеально нечувствителен к биохимическим изменениям внутри органеллы(рисунок 1D–F)и поэтому может быть использован для коррекции изменений в фокальной плоскости, органелларного объема и, в некоторой степени, фотоотбеливания23. Используя этот подход, называемый двойной флуорофорной ратиометрической флуоресценцией, коррекция может быть достигнута путем генерации отношения флуоресцентного излучения параметрического флуорофора к эталонного флуорофора.
Здесь протокол будет использовать принцип двойной флуорофорной ратиометрической визуализации для измерения рН, окислительных событий и деградации белка в макропиносомах. В каждом случае будет выбран флуорофор, чувствительный к интересуя параметру и эталонный флуорофор. Для того, чтобы нацеливать флуорофоры конкретно на макропиносомы, они будут ковалентно связаны с декстраном 70 кДа, который предпочтительно включен в макропиносомы24. Все анализы будут выполняться в клетках Raw264.7, но могут быть адаптированы к другим типам клеток. Там, где это возможно, коэффициенты флуоресценции будут откалиброваны по контрольной кривой для получения абсолютных значений. Важно отметить, что все измерения будут проводиться в живых клетках для динамической и количественной оценки просветной среды макропиносом.
При выборе pH-чувствительных флуорофоров необходимо взвесить ряд соображений. Первым является pKa флуорофора, который указывает диапазон значений pH, при котором зонд будет наиболее чувствительным. Если предположить, что вскоре после образования рН макропиносомы будет близок к рН внеклеточной среды (~рН 7,2) и что она будет постепенно подкисляться посредством взаимодействий с поздними эндосомами и лизосомами (~рН 5,0), то следует выбрать зонд с pKa, чувствительный в этом диапазоне(рисунок 2C). Флуорофорный флуоресцеин, который имеет pKa 6,4, оптимально чувствителен в этом диапазоне. Он широко использовался для измерения других подобных органелл, таких как фагосомы, и будет флуорофором выбора в этой рукописи22,25. В качестве эталонного флуорофора будет использоваться тетраметилродамин, который нечувствителен к рН(рисунок 1Е). Другие флуорофоры, такие как pHrodo и cypHer5e, могут быть заменены флуоресцеином, где спектральные свойства флуоресцеина соответствуют другим экспериментальным переменным. Некоторые предложенные эталонные флуорофоры для pHrodo и cypHer5e показаны на рисунке 1.
Вторым соображением является метод, с помощью которого два флуорофора будут нацелены конкретно на макропиносомы. Декстран размером 70 кДа, который имеет гидродинамический радиус примерно 7 нм, не прилипает неспециально к клеткам и включен в макропиносомы, но не покрытые клатрином ямки или кавеолы, и поэтому маркирует макропиносомы(Фиг.2А и Фиг.3А,В)16,24,26. В этом протоколе в качестве pH-чувствительных и эталонных зондов, соответственно, будут использоваться флуоресцеин-меченый декстран и тетраметилродамин (TMR) 70 кДа декстран.
В врожденных иммунных клетках макропиноцитоз и фагоцитоз представляют собой два основных пути интернализации экзогенного материала для обработки и последующего представления клеткам адаптивного иммунного ответа27. Тщательный и скоординированный контроль окислительно-восстановительной химии просвета фагосом и макропиносом имеет решающее значение для контекстно-специфической обработки экзогенного материала. Возможно, наиболее хорошо изученным регулятором окислительных событий в фагосомах является NADPH-оксидаза, большой многосубидный комплекс, который производит большое количество активных форм кислорода (АФК) в просвете фагосом28. Действительно, его активность занимает центральное место в соответствующей обработке антигена в фагосомах29,30. Тем не менее, активность NADPH-оксидазы на макропиносомных мембранах не была изучена.
В этом протоколе сукцинимидиловый эфир H2DCFDA используется для измерения окислительных событий в макропиносоме. Это модифицированная форма флуоресцеина (2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеина диацетат), которая минимально флуоресцентна в своей восстановленной форме. При окислении его флуоресцентное излучение значительно увеличивается. Стоит, однако, отметить существенное предостережение H2DCFDA – поскольку он основан на флуорофорном флуоресцеине, его флуоресценция также гасится в кислотных компартментах, и необходимо соблюдать осторожность для контроля этой переменной при разработке экспериментов28. Аналогично подходу к измерению рН, сукцинимидиловый эфир H2DCFDA будет ковалентно присоединен к декстрану 70 кДа, а декстран с маркировкой TMR 70 кДа будет использоваться в качестве эталонного флуорофора(рисунок 3A).
Флуоресцентный овальбумин будет использоваться для измерения деградации белка в макропиносомах. Используемый здесь овальбумин плотно маркирован красителем FL 4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-с-идацен (BODIPY) FL, который является самозакаленным. При пищеварении высвобождаются сильно флуоресцентные пептиды, меченые красителем. Поскольку овальбумин не может быть легко конъюгирован с декстраном 70 кДа, клетки с меченым TMR декстраном 70 кДа и жидкофазным овальбумином будут совместно инкубированы. Сигнал TMR будет использоваться для генерации маски макропиносом во время поствизуального анализа, а сигнал, высвобождаемый из перевареного овальбумина, будет измеряться внутри маски(рисунок 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя существует ряд протоколов как для низкопроизводительных, так и для высокопроизводительных измерений поглощения макропиноцитов в макрофагах, фибробластах и даже Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,было п?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Университет Калгари за его поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Робина Йейтса за доступ к реагентам, оборудованию и полезным дискуссиям.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
Referências
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
