Mätning av makropinosomernas pH-, Redoxkemi och degraderande kapacitet med dubbelfluorfor ratiometrisk mikroskopi

Summary

Vi beskriver protokoll för mätning av pH, oxidativa händelser och protein matsmältning i enskilda makropinosomer i levande celler. Tonvikten läggs på dubbelfluoroforkvotetrisk mikroskopi och de fördelar den erbjuder jämfört med befolkningsbaserade tekniker.

Abstract

Under de senaste åren har området makropinocytos vuxit snabbt. Macropinocytosis har dykt upp som en central mekanism genom vilken medfödda immunceller upprätthåller organismisk homeostas och immunitet. Samtidigt, och i motsats till dess homeostatiska roll, kan det också driva olika patologier, inklusive cancer och virusinfektioner. Till skillnad från andra lägen av endocytos förblir verktygen som utvecklats för att studera mognad av makropinosomer underutvecklade. Här beskriver protokollet nyutvecklade verktyg för att studera redoxmiljön inom lumen av tidiga och mogna makropinosomer. Metoder för användning av ratiometric fluorescensmikroskopi vid bedömning av pH, produktion av reaktiva syre arter och den nedbrytbara kapaciteten inom lumen av enskilda makropinosomer i levande celler beskrivs. Enstaka organelle mätningar erbjuder fördelen att avslöja spatiotemporal heterogenitet, som ofta går förlorad med befolkningsbaserade metoder. Tonvikten läggs på de grundläggande principerna för dubbel fluorfor ratiometric mikroskopi, inklusive sondval, instrumentering, kalibrering och encelliga kontra befolkningsbaserade metoder.

Introduction

Makropinocytos avser upptag av stora mängder extracellulär vätska i membranbundna cytoplasmaorganeller som kallas makropinosomer^1,2. Det är en mycket bevarad process som utförs av frilevande encelliga organismer, såsom amoeba Dictyostelium spp. ³, liksom anthozoans⁴ och metazoaner². I de flesta celler är makropinocytos en inducerad händelse. Ligaturen av cell-ytreceptorer inducerar utskjutning av aktindrivna plasmamembranförlängningar som kallas volanger. En bråkdel av dessa volanger, av någon dåligt förstådd mekanism, förseglar vid sina distala tips för att bilda makropinosomer (även om det ligger utanför tillämpningsområdet för detta metodpapper, för detaljerade recensioner om mekaniken för makropinocytos, se referenser^1,2,5,6,7). Den extracellulära stimulansen som inducerar makropinocytos är oftast en löslig tillväxtfaktor^5,8. Följaktligen möjliggör den makropinocytiska händelsen intag av en bolus av extracellulärt material från vilket cellen kan härleda användbara metaboliter för att underlätta tillväxten. Tyvärr kan denna väg för näringstillförsel också driva patologi. Vissa cancerceller hyser mutationer som resulterar i kontinuerlig eller konstituerande makropinocytos. Kontinuerlig leverans av näringsämnen underlättar okontrollerad spridning av cancerceller och har kopplats till särskilt aggressiva tumörer^{9,10,11,12,13}. På samma sätt kan virus inducera makropinocytos för att få tillgång till värdceller, vilket driver viral patologi¹⁴.

Makropinocytos fungerar också vid upprätthållande av immunitet mot patogener. Vissa medfödda immunceller som makrofager och dendritiska celler deltar i den konstituerande och aggressiva provtagningen av extracellulär vätska via makropinocytos^6,15,16. Detta läge av makropinocytos är otroligt aktivt, och en enda dendritisk cell kan engorge sig med en volym extracellulär vätska som motsvarar sin egen vikt varje timme¹⁷. Trots denna konstituerande provtagning replikerar makrofager och dendritiska celler inte okontrollerat liksom tumörceller, istället verkar de bearbeta det extracellulära materialet på ett sådant sätt att information kan extraheras för att informera om förekomsten, eller för den delen frånvaron, av potentiella hot. Information extraheras som i) patogen-associerade molekylära mönster som kan läsas av intracellulära patogen erkännande receptorer och ii) korta sträckor av aminosyror som kan laddas på stora histocompatibility molekyler för screening av celler i det adaptiva immunsystemet^16,18,19. Huruvida patogener undergräver denna väg för informationsbehandling av immunceller är för närvarande oklart.

Trots dessa väldefinierade och kritiska roller för makropinocytos i både upprätthållandet av immunitet och homeostas och i motsats till andra vanligare studerade lägen av endocytos, är lite av de inre (luminal) arbete av makropinosomer känt. Att utveckla standardiserade protokoll och verktyg för att studera makropinosomernas luminala biokemi kommer inte bara att hjälpa oss att förstå deras unika biologi bättre utan kommer att ge insikt som kan utnyttjas för nya terapeutiska strategier, inklusive läkemedelsleverans²⁰. Detta metodmanuskript kommer att fokusera på nyligen utvecklade verktyg för att på enorganellnivå dissekera olika aspekter av makropinosomernas luminalbiokemi.

Fluorforer kan användas för att mäta specifika biokemier av organeller om i) de delar företrädesvis in i det intresseområde och/eller ii) de genomgår spektralförändringar som svar på den parameter som är av intresse. Till exempel, när det gäller pH, fluorescerande svaga baser, såsom acridine apelsin, cresyl violett, och LysoTracker färgämnen ackumuleras företrädesvis i sura organeller. Därför är deras relativa intensitet en grov indikation på att den märkta organellen är sur. Andra pH-responsiva fluorforer, såsom fluorescein, pHrodo och cypHer5e, genomgår spektralförändringar vid bindning till protoner (figur 1A–C). Förändringar i fluorescensutsläppet av pH-känsliga fluorforer kan därför ge en användbar approximation av pH. Användningen av enstaka fluorforer innebär dock ett antal nackdelar. Till exempel kan ändringar i fokalplanet, fotoblekning och förändringar i volymen av enskilda organeller, en vanlig förekomst i makropinosomer²¹, inducera förändringar i fluorescensintensiteten hos enstaka fluorforer, och detta kan inte enkelt korrigeras för²². Envågiga bedömningar, även om de är användbara för visualisering av sura fack, är därför rent kvalitativa.

Ett mer kvantitativt tillvägagångssätt är att rikta in sig på den parameterkänsliga fluorforen tillsammans med en referensfluorofor till organellen av intresse. Referensfluorforen är idealiskt okänslig för biokemiska förändringar inom organellen (figur 1D–F) och kan därför användas för att korrigera för förändringar i brännplanet, organellär volym och i viss utsträckning fotoblekning²³. Med hjälp av detta tillvägagångssätt, som kallas dubbelfluorforförhållandet fluorescens, kan korrigering uppnås genom att generera ett förhållande mellan fluorescensutsläppet av parameterkänslig fluorfor och referensfluorforen.

Här kommer protokollet att använda principen om dubbelfluorfor ratiometric imaging för att mäta pH, oxidativa händelser och protein nedbrytning inom makropinosomer. I varje enskilt fall väljs en fluorofor som är känslig för parametern av intresse och en referensfluorofor. För att rikta fluorforerna specifikt till makropinosomer kommer de att kovaly kopplas till 70 kDa dextran, som företrädesvis införlivas i makropinosomer²⁴. Alla analyser kommer att utföras i Raw264,7-celler men kan anpassas till andra celltyper. Om möjligt kalibreras fluorescenskvoterna mot en referenskurva för att få absoluta värden. Viktigt är att alla mätningar utförs i levande celler för dynamisk och kvantitativ bedömning av makropinosomernas luminala miljö.

Vid val av pH-känsliga fluorforer måste ett antal överväganden vägas. Den första är pK_{a av} fluorforen, som anger intervallet av pH-värden vid vilka sonden kommer att vara mest känslig. Om det antas att makropinosomens pH kort efter bildandet kommer att ligga nära det extracellulära mediet (~pH 7.2) och att det gradvis kommer att försuras genom interaktioner med sena endosomer och lysosomer (~pH 5.0), bör en sond med en pK_a som är känslig inom det intervallet (figur 2C) väljas. Fluorforfluorescein, som har en pK_a på 6,4, är optimalt känslig inom det intervallet. Det har använts i stor utsträckning för att mäta andra liknande organeller, såsom fagosomer, och kommer att vara fluorforen i detta manuskript^22,25. Som referensfluorfor kommer tetrametritylramhodamin att användas, vilket är okänsligt för pH(figur 1E). Andra fluorforer, såsom pHrodo och cypHer5e, kan ersätta fluorescein där fluoresceins spektralegenskaper matchar andra experimentella variabler. Några föreslagna referensfluoroforer för pHrodo och cypHer5e visas i figur 1.

En andra faktor är den metod genom vilken de två fluorforerna kommer att riktas specifikt mot makropinosomer. Dextran av storleken 70 kDa, som har en hydrodynamisk radie på ungefär 7 nm, håller sig inte specifikt till celler och ingår i makropinosomer, men inte clathrinbelagda gropar eller grottor, och markerar därför makropinosomer (figur 2A och figur 3A, B)^16,24,26. I detta protokoll kommer fluoresceinmärkt 70 kDa dextran- och tetramethylrhodamine (TMR)-märkta 70 kDa dextran att användas som pH-känsliga respektive referenssonder.

I medfödda immunceller representerar makropinocytos och fagocytos de två viktigaste vägarna för internalisering av exogent material för bearbetning och efterföljande presentation till celler i det adaptiva immunsvaret²⁷. Noggrann och samordnad kontroll av redox kemin av lumen av phagosomes och makropinosomer är avgörande för den kontextspecifika bearbetningen av exogent material. Kanske den mest studerade regulatorn av oxidativa händelser i faagosomer är NADPH-oxidasen, ett stort multiunderavdelningskomplex som producerar stora mängder reaktiva syrearter (ROS) inom lumen av phagosomer²⁸. Dess verksamhet är i själva hand central för lämplig antigenbearbetning inom phagosomerna^29,30. Ändå har aktiviteten hos NADPH-oxidasen på makropinosomala membran inte utforskats.

I detta protokoll används H2DCFDA succinimidyl ester för att mäta oxidativa händelser inom makropinosomen. Detta är en modifierad form av fluorescein (2′,7′-diklordihydrofluorescein diacetat), som är minimalt fluorescerande i sin reducerade form. Vid oxidation ökar dess fluorescensutsläpp avsevärt. Det är dock värt att notera en betydande varning om H2DCFDA – eftersom den är baserad på fluorforfluorescein, är dess fluorescens också släckt i sura fack, och man måste vara noga med att kontrollera denna variabel när man utformar experiment²⁸. I likhet med metoden för mätning av pH kommer H2DCFDA-succinimidylestern att kovaleras till 70 kDa dextran- och TMR-märkta 70 kDa dextran användas som referensfluorfor (figur 3A).

Fluorescerande ovalbumin kommer att användas för att mäta proteinnedbrytning inom makropinosomer. Ovalbumin som används här är tätt märkt med ett 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL färgämne som är självsläckt. Vid matsmältningen frigörs starkt fluorescerande färgmärkta peptider. Eftersom ovalbumin inte lätt kan konjugeras till 70 kDa dextran, kommer celler med TMR-märkta 70 kDa dextran och fluidfas ovalbumin att vara saminkuberade. TMR-signalen kommer att användas för att generera en makropinosommask under analysen efter avbildningen, och signalen som frigörs från den smälta ovalbuminen mäts i masken (figur 3B).

Protocol

1. Beredning av celler Odla Raw264,7 celler vid 37 °C och 5% CO2 till 70% sammanflöde i RPMI kompletterat med 10% värmeinaktiverat serum. En dag före analysen, så frön Raw264.7 celler med en densitet av 5 x 104 celler per brunn i en 96-brunnsplatta. Se till att varje brunn innehåller 100 μL tillväxtmedium. Se till att 96-brunnsplattan har svarta sidor och en glasbotten för avbildning.OBS: Här användes 96-brunnsplattor för avbildning. 96-brunnsplattorna möjliggö…

Representative Results

Vid mätning av makropinosom pH finns det en tidsperiod för vilken försurningsdynamiken inte kan mätas. Denna period motsvarar dextran-inläsningsfasen (grå ruta i figur 2C och figur 3C,D) och varierar beroende på vilken celltyp som används. Belastningsfasens längd varierar med i) cellernas makropinocytiska aktivitet och ii) känsligheten hos det instrument som används. Det rekommenderas att justera denna period i början av varje experi…

Discussion

Även om det finns ett antal protokoll för både låg och hög genomströmning mätningar av makropinocytic upptag i makrofager, fibroblaster och även Dictyostelium spp. ^3,7,31,32,33, mycket få försök har gjorts att mäta den luminala biokemin i dessa dynamiska fack. Detta beror sannolikt på en brist på sonder som effektivt kan riktas till makr…

Materials

Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	–
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156