Isoliertes Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell
Summary
Das isolierte Kaninchenlungenpräparat ist ein Goldstandardwerkzeug in der Lungenforschung. Diese Publikation zielt darauf ab, die Technik zu beschreiben, die für die Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen entwickelt wurde, die an der Reaktivität der Atemwege, der Lungenerhaltung und der präklinischen Forschung bei Lungentransplantationen und Lungenödemen beteiligt sind.
Abstract
Das isolierte Lungenperfusionssystem wurde in der Lungenforschung weit verbreitet eingesetzt und trägt dazu bei, das Innenleben der Lunge sowohl mikro- als auch makroskopisch aufzuklären. Diese Technik ist nützlich bei der Charakterisierung der Lungenphysiologie und -pathologie durch Messung von Stoffwechselaktivitäten und Atmungsfunktionen, einschließlich Wechselwirkungen zwischen Kreislaufsubstanzen und den Wirkungen von eingeatmeten oder perfundierten Substanzen, wie bei Arzneimitteltests. Während In-vitro-Methoden das Schneiden und Kultivieren von Geweben beinhalten, ermöglicht das isolierte ex vivo Lungenperfusionssystem die Arbeit mit einem vollständigen funktionellen Organ, das die Untersuchung einer kontinuierlichen physiologischen Funktion ermöglicht und gleichzeitig Beatmung und Perfusion nachbildet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Auswirkungen des Fehlens einer zentralen Innervation und Lymphdrainage noch vollständig bewertet werden müssen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Aufbau des isolierten Lungenapparates zu beschreiben, gefolgt von der chirurgischen Extraktion und Kanülierung von Lunge und Herz aus experimentellen Labortieren, sowie die Perfusionstechnik und Signalverarbeitung von Daten darzustellen. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit der isolierten Lunge liegt zwischen 5-8 h; Während dieser Zeit nimmt die pulmonale Kapillarpermeabilität zu, was zu Ödemen und Lungenverletzungen führt. Die Funktionalität des konservierten Lungengewebes wird durch den Kapillarfiltrationskoeffizienten (Kfc) gemessen, der verwendet wird, um das Ausmaß des Lungenödems im Laufe der Zeit zu bestimmen.
Introduction
Brodie und Dixon beschrieben das ex-vivo-Lungenperfusionssystem erstmals 1903 1. Seitdem ist es zu einem Goldstandardwerkzeug für das Studium der Physiologie, Pharmakologie, Toxikologie und Biochemie der Lunge geworden2,3. Die Technik bietet eine konsistente und reproduzierbare Möglichkeit, die Lebensfähigkeit von Lungentransplantationen zu bewerten und die Wirkung von Entzündungsmediatoren wie Histamin, Arachidonsäure-Metaboliten und Substanz P sowie deren Wechselwirkungen bei Lungenphänomenen wie Bronchokonstriktion, Atelektase und Lungenödem zu bestimmen. Das isolierte Lungensystem war eine Schlüsseltechnik bei der Aufdeckung der wichtigen Rolle der Lunge bei der Eliminierung biogener Amine aus dem allgemeinen Kreislauf4,5. Darüber hinaus wurde das System verwendet, um die Biochemie von Lungentensid6 zu bewerten. In den letzten Jahrzehnten hat sich das ex-vivo-Lungenperfusionssystem zu einer idealen Plattform für die Lungentransplantationsforschung entwickelt7. Im Jahr 2001 beschrieb ein Team um Stig Steen die erste klinische Anwendung des ex-vivo-Lungenperfusionssystems, indem es die Lunge eines 19-jährigen Spenders rekonditionierte, der aufgrund seiner Verletzungen zunächst von Transplantationszentren abgelehnt wurde. Die linke Lunge wurde geerntet und für 65 min perfundiert; Danach wurde es erfolgreich in einen 70-jährigen Mann mit COPD8 transplantiert. Weitere Forschungen zur Lungenrekonditionierung unter Verwendung der ex-vivo-Perfusion führten zur Entwicklung der Toronto-Technik für eine verlängerte Lungenperfusion zur Beurteilung und Behandlung verletzter Spenderlungen9,10. Klinisch hat sich das ex-vivo-Lungenperfusionssystem als sichere Strategie zur Erhöhung der Spenderpools durch Behandlung und Rekonditionierung substandardisierter Spenderlungen erwiesen, wobei sich die Risiken oder Ergebnisse nicht signifikant von den Standardkriterien der Spender unterscheiden10.
Der Hauptvorteil des isolierten Lungenperfusionssystems besteht darin, dass die experimentellen Parameter in einem vollständigen Funktionsorgan ausgewertet werden können, das seine physiologische Funktion unter einem künstlichen Laboraufbau bewahrt. Darüber hinaus ermöglicht es die Messung und Manipulation der pulmonalen mechanischen Beatmung, um die Komponenten der Lungenphysiologie wie Atemwegswiderstand, gesamter Gefäßwiderstand, Gasaustausch und Ödembildung zu analysieren, die bisher nicht genau in vivo an Labortieren gemessen werden können2. Insbesondere kann die Zusammensetzung der Lösung, mit der die Lunge durchblutet wird, vollständig kontrolliert werden, was die Zugabe von Substanzen zur Bewertung ihrer Wirkung in Echtzeit und die Probenentnahme aus der Perfusion für weitere Studien ermöglicht11. Forscher, die mit dem isolierten Lungensystem arbeiten, sollten bedenken, dass die mechanische Beatmung den Zerfall des Lungengewebes verursacht und seine nützliche Zeit verkürzt. Dieser fortschreitende Abfall der mechanischen Parameter kann durch gelegentliche Hyperinflation der Lunge während der Zeit des Experiments signifikant verzögert werden4. Dennoch kann die Zubereitung in der Regel nicht länger als acht Stunden dauern. Eine weitere Überlegung für das ex-vivo-Lungenperfusionssystem ist das Fehlen einer zentralen Nervenregulation und Lymphdrainage. Die Auswirkungen ihres Fehlens sind noch nicht vollständig verstanden und könnten in bestimmten Experimenten möglicherweise eine Quelle der Verzerrung sein.
Die isolierte Lungenperfusionssystemtechnik kann im Kaninchenmodell mit einem hohen Grad an Konsistenz und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Diese Arbeit beschreibt die technischen und chirurgischen Verfahren für die Implementierung der ex-vivo isolierten Lungenperfusionstechnik, wie sie für das Kaninchenmodell am Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias in Mexiko-Stadt entwickelt wurde, um die Erkenntnisse zu teilen und einen klaren Leitfaden für Schlüsselschritte bei der Anwendung dieses experimentellen Modells zu geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit zeigt einen allgemeinen Überblick über das isolierte Lungenperfusionssystem, eine wesentliche Technik in der lungenphysiologischen Forschung. Das isolierte Lungenperfusionssystem bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit in seiner Anwendung und ermöglicht die Bewertung mehrerer Parameter, die für die Prüfung einer Vielzahl von Hypothesen relevant sind15. Ein isoliertes Lungensystem ist ein weltweit präsentes Werkzeug, das in den letzten zehn Jahren seine Relevanz für organspezifi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ph.D. Bettina Sommer Cervantes für ihre Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts und Kitzia Elena Lara Safont für ihre Unterstützung bei den Illustrationen.
Materials
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
Referências
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