Den isolerte kanin lungepreparatet er et gullstandardverktøy i lungeforskning. Denne publikasjonen tar sikte på å beskrive teknikken som utviklet for studiet av fysiologiske og patologiske mekanismer involvert i luftveisreaktivitet, lungebevaring og preklinisk forskning innen lungetransplantasjon og lungeødem.
Det isolerte lungeperfusjonssystemet har vært mye brukt i lungeforskning, noe som bidrar til å belyse lungenes indre arbeid, både mikro- og makroskopisk. Denne teknikken er nyttig i karakteriseringen av lungefysiologi og patologi ved å måle metabolske aktiviteter og åndedrettsfunksjoner, inkludert interaksjoner mellom sirkulasjonsstoffer og effekten av inhalerte eller perfunderte stoffer, som i legemiddeltesting. Mens in vitro-metoder involverer kutting og dyrking av vev, gjør det isolerte ex vivo lungeperfusjonssystemet det mulig å jobbe med et komplett funksjonelt organ som gjør det mulig å studere en kontinuerlig fysiologisk funksjon mens du gjenskaper ventilasjon og perfusjon. Det skal imidlertid bemerkes at effekten av fraværet av sentral innervering og lymfatisk drenering fortsatt må vurderes fullt ut. Denne protokollen tar sikte på å beskrive monteringen av det isolerte lungeapparatet, etterfulgt av kirurgisk ekstraksjon og kannkulasjon av lunger og hjerte fra eksperimentelle laboratoriedyr, samt å vise perfusjonsteknikk og signalbehandling av data. Den gjennomsnittlige levedyktigheten til den isolerte lungen varierer mellom 5-8 timer; I løpet av denne perioden øker lungekapillær permeabilitet, forårsaker ødem og lungeskade. Funksjonaliteten til bevart lungevev måles av kapillærfiltreringskoeffisienten (Kfc), som brukes til å bestemme omfanget av lungeødem gjennom tidene.
Brodie og Dixon beskrev først ex-vivo lungeperfusjonssystemet i 1903 1. Siden da har det blitt et gullstandardverktøy for å studere lungenes fysiologi, farmakologi, toksikologi og biokjemi2,3. Teknikken gir en konsistent og reproduserbar måte å evaluere levedyktigheten av lungetransplantasjoner, og å bestemme effekten av inflammatoriske mediatorer som histamin, arakidonsyremetabolitter og substans P, blant andre, samt deres interaksjoner under lungefenomener som bronkokonstriksjon, atelektase og lungeødem. Det isolerte lungesystemet har vært en nøkkelteknikk for å avdekke lungenes viktige rolle i eliminering av biogene aminer fra generell sirkulasjon4,5. I tillegg har systemet blitt brukt til å evaluere biokjemien til lungeoveraktivt middel6. I løpet av de siste tiårene har ex-vivo lungeperfusjonssystemet blitt en ideell plattform for lungetransplantasjonsforskning7. I 2001 beskrev et team ledet av Stig Steen den første kliniske anvendelsen av ex-vivo lungeperfusjonssystemet ved å bruke det til å rekondisjonere lungene til en 19 år gammel donor, som først ble avvist av transplantasjonssentre på grunn av skadene. Venstre lunge ble høstet og perfundert i 65 min; Etterpå ble det vellykket transplantert inn i en 70 år gammel mann med KOLS8. Videre forskning på lunge rekondisjonering ved hjelp av ex-vivo perfusjon førte til utvikling av Toronto-teknikken for utvidet lungeperfusjon for å vurdere og behandle skadede donor lunger9,10. Klinisk har ex-vivo lungeperfusjonssystemet vist seg å være en sikker strategi for å øke donorpoolene ved å behandle og rekondisjonere substandard donor lunger, og presenterer ingen signifikant forskjell i risiko eller utfall mot standardkriterier donorer10.
Den største fordelen med det isolerte lungeperfusjonssystemet er at de eksperimentelle parametrene kan evalueres i et komplett funksjonelt organ som bevarer sin fysiologiske funksjon under et kunstig laboratorieoppsett. Videre tillater det måling og manipulering av lungemekanisk ventilasjon for å analysere komponentene i lungefysiologi som luftveismotstand, total vaskulær motstand, gassutveksling og ødemdannelse, som til dags dato ikke kan måles nøyaktig in vivo på laboratoriedyr2. Spesielt kan sammensetningen av løsningen som lungen er perfundert, kontrolleres fullt ut, slik at tilsetning av stoffer kan evaluere effektene i sanntid og prøveinnsamling fra perfusjon for videre studier11. Forskere som arbeider med det isolerte lungesystemet bør huske på at mekanisk ventilasjon forårsaker forfall av lungevevet som forkorter sin brukne tid. Dette progressive fallet i mekaniske parametere kan bli betydelig forsinket ved å hyperinflisere lungene av og til i løpet av eksperimentets tid4. Likevel kan preparatet vanligvis ikke vare mer enn åtte timer. En annen vurdering for ex-vivo lungeperfusjonssystemet er fraværet av sentralnerveregulering og lymfatisk drenering. Effektene av deres fravær er ennå ikke fullt ut forstått og kan potensielt være en kilde til skjevheter i visse eksperimenter.
Den isolerte lungeperfusjonssystemteknikken kan utføres i kaninmodellen med høy grad av konsistens og reproduserbarhet. Dette arbeidet beskriver de tekniske og kirurgiske prosedyrene for implementeringen av den tidligere vivo-isolerte lungeperfusjonsteknikken som utviklet for kaninmodellen ved Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias i Mexico City, som har til hensikt å dele innsikten og gi en klar guide til viktige trinn i anvendelsen av denne eksperimentelle modellen.
Dette arbeidet viser et generelt syn på det isolerte lungeperfusjonssystemet, en viktig teknikk i lungefysiologiforskning. Det isolerte lungeperfusjonssystemet gir en stor grad av allsidighet i bruken og tillater evaluering av flere parametere som er relevante for testing av et bredt spekter av hypoteser15. Et isolert lungesystem er et verktøy med verdensomspennende tilstedeværelse som i løpet av det siste tiåret har ytterligere etablert sin relevans for organspesifikke evalueringer og også …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Ph.D. Bettina Sommer Cervantes for hennes støtte i skrivingen av dette manuskriptet, og Kitzia Elena Lara Safont for hennes støtte til illustrasjonene.
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
Eppendorf tubes | |||
Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
Falcon tubes | 14 mL | ||
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
Heparin | PISA | 5000 UI | |
HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
New Zeland rabbits | |||
PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
Scalpel knife | |||
Serotonin 5-HT | |||
Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
Surgical gloves No. 8 | |||
Taygon tubes | Masterflex | ||
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |