Определение функций генов в опухолевом генезе путем абляции Ex vivo флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения нокаутов генов, которые являются эмбриональными летальными in vivo в генетически модифицированных опухолях, полученных из мышиной модели, а затем оцениваем влияние, которое нокаут оказывает на рост опухоли, пролиферацию, выживание, миграцию, инвазию и транскриптом in vitro и in vivo.

Abstract

Разработка новых лекарств, которые точно нацелены на ключевые белки при раке человека, коренным образом изменяет терапию рака. Однако, прежде чем эти препараты могут быть использованы, их целевые белки должны быть подтверждены в качестве терапевтических мишеней при конкретных типах рака. Эта проверка часто выполняется путем выбивания гена, кодирующего потенциальную терапевтическую мишень в генно-инженерной мышиной модели рака (GEM), и определения того, какое влияние это оказывает на рост опухоли. К сожалению, технические проблемы, такие как эмбриональная летальность в обычных нокаутах и мозаицизм в условных нокаутах, часто ограничивают этот подход. Чтобы преодолеть эти ограничения, был разработан подход к абляции флоксированного эмбрионального летального гена, представляющего интерес в краткосрочных культурах злокачественных опухолей оболочки периферических нервов (MPNST), генерируемых в модели GEM.

В этой статье описывается, как установить модель мыши с соответствующим генотипом, получить краткосрочные опухолевые культуры от этих животных, а затем аблактировать флокированный эмбриональный летальный ген с использованием аденовирусного вектора, который экспрессирует рекомбиназу Cre и усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP). Затем подробно описывается очистка клеток, трансдуцированных аденовирусом, с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и количественная оценка эффектов, которые абляция генов оказывает на клеточную пролиферацию, жизнеспособность, транскриптом и рост ортотопического аллотрансплантата. Эти методологии обеспечивают эффективный и обобщающий подход к выявлению и подтверждению терапевтических мишеней in vitro и in vivo. Эти подходы также обеспечивают возобновляемый источник низкопроходимых опухолевых клеток с уменьшенными артефактами роста in vitro . Это позволяет изучать биологическую роль гена-мишени в различных биологических процессах, таких как миграция, инвазия, метастазирование и межклеточная связь, опосредованная секретомом.

Introduction

До последних двух десятилетий лечение рака человека в значительной степени зависело от лучевой терапии и химиотерапевтических агентов, которые широко нацеливались на быстро размножающиеся клеточные популяции, повреждая ДНК или ингибируя синтез ДНК. Хотя эти подходы ингибировали рост раковых клеток, они также имели вредные побочные эффекты на нормальные быстро размножающиеся типы клеток, такие как эпителиальные клетки кишечника и клетки волосяных фолликулов. Совсем недавно терапия рака начала использовать химиотерапевтические агенты, которые точно нацелены на белки в сигнальных путях, которые критически важны для роста новообразования отдельного пациента. Этот подход, обычно называемый «прецизионной медициной», привел к разработке постоянно расширяющегося репертуара моноклональных антител и малых молекулярных ингибиторов. Эти агенты эффективно ингибируют пролиферацию и выживание опухолевых клеток, избегая вредных побочных эффектов на нормальные типы клеток, наблюдаемых с помощью обычных химиотерапевтических агентов и лучевой терапии. Моноклональные антитела, используемые для лечения рака человека, чаще всего нацелены на молекулы клеточной поверхности, такие как рецепторы фактора роста¹ (например, большое семейство тирозинкиназ мембранных рецепторов) и модуляторы иммунного ответа² (например, запрограммированный белок гибели клеток 1, запрограммированный лиганд смерти 1). Малые молекулярные ингибиторы могут ингибировать либо белки клеточной поверхности, либо сигнальные белки, которые расположены внутриклеточным^{образом 3}. Однако, чтобы эффективно использовать эти новые терапевтические агенты, необходимо установить, что конкретный рак зависит от молекулы, на которую нацелен кандидат терапевтический агент.

Хотя эти новые терапевтические агенты имеют более целенаправленные эффекты, многие из них по-прежнему ингибируют действие более чем одного белка. Кроме того, несколько агентов с различной эффективностью и специфичностью часто доступны для нацеливания на конкретный белок. Следовательно, во время доклинических исследований целесообразно использовать дополнительные подходы, такие как генетическая абляция, для проверки белка-кандидата в качестве терапевтической мишени. Одним из особенно полезных подходов к проверке белка в качестве терапевтической мишени является удаление гена, кодирующего белок-кандидат, в генетически модифицированной животной модели, которая развивает конкретный тип рака. Этот подход может быть относительно простым, если мыши с нулевой мутацией (либо естественная мутация, либо генетически модифицированная нулевая мутация [«нокаут»], либо нулевая мутация, введенная генной ловушкой), доступны, и мыши жизнеспособны во взрослой жизни. К сожалению, мыши с нулевой мутацией, которые соответствуют этим критериям, часто недоступны, как правило, потому, что нулевая мутация приводит к смерти эмбрионально или в первые дни постнатальной жизни. В этом случае мыши, склонные к развитию опухолевого типа интереса, могут быть вместо этого скрещены с мышами, у которых ключевые сегменты интересующего гена окружены участками loxP («floxed»), что позволяет удалять ген путем введения трансгена, экспрессирующего Cre recombinase в опухолевые клетки (условный нокаут). Такой подход дает ряд преимуществ. Во-первых, если доступен драйвер Cre, который экспрессируется в опухоли, но не в типе клеток, который привел к смерти в обычных нокаутах, этот подход может потенциально подтвердить потенциальную терапевтическую мишень. Во-вторых, удаление гена, кодирующего белок-кандидат в опухолевых клетках, но не в других внутриопухолевых элементах, таких как опухолеассоциированные фибробласты или иммунные клетки, позволяет исследователю различать клеточные автономные и неклеточные автономные эффекты терапевтической мишени. Наконец, индуцируемый тамоксифен драйвером Cre (CreER^T2) позволяет исследователю удалить ген, представляющий интерес на разных стадиях развития опухоли, и определить окно, в котором потенциальный терапевтический агент, скорее всего, будет эффективным.

К сожалению, существуют и технические проблемы, которые могут ограничить использование условных нокаутов при опухолях, возникающих в моделях GEM. Например, драйвер Cre, который экспрессируется в опухолевых клетках и избегает делеции генов в нормальных клетках, необходимых для жизни, может быть недоступен. Другая проблема, которую можно недооценивать, заключается в том, что драйверы Cre и CreER^T2 часто по-разному удаляют флоксированные аллели у мышей, что приводит к мозаицизму для нулевой мутации при раке GEM. Когда это происходит, опухолевые клетки, в которых ген-мишень не был абляционным, будут продолжать быстро размножаться, перерастая опухолевые клетки с помощью абляционных аллелей. Мозаицизм в линиях драйвера Cre может возникать из-за не вездесущей экспрессии Cre в целевой линии и неудачной рекомбинации в отдельных клетках, независимых от экспрессии Cre⁴. Это известное явление драйверов Cre, которое зависит от клеточного типа и должно быть рассмотрено при экспериментальном проектировании и интерпретации данных. Мозаицизм может замаскировать эффект нокаута и привести исследователя к ошибочному выводу, что ген, представляющий интерес, не является существенным для пролиферации опухолевых клеток и / или выживания и, следовательно, не является действительной терапевтической мишенью.

Некоторые из этих проблем были обнаружены в предыдущем исследовании, в котором пытались определить, является ли рецептор тирозинкиназы erbB4 потенциальной терапевтической мишенью в клетках MPNST⁵. В этих исследованиях использовались мыши, которые экспрессируют трансген, кодирующий изоформу глиального фактора роста неурегулина-1 (NRG1)-β3 (GGFβ3) под контролем нулевого промотора миелинового белка Шванна (мыши P 0-GGFβ3). У мышей P 0-GGFβ3 развиваются множественные плексиформные нейрофибромы, которые прогрессируют, чтобы стать MPNST посредством процесса, который повторяет процессы патогенеза нейрофибромы и прогрессирование плексиформной нейрофибромы-MPNST, наблюдаемое у пациентов с синдромом аутосомно-доминантной восприимчивости к опухоли нейрофиброматоза типа 1 (NF1)⁶. При скрещивании с мышами с нулевой мутацией Trp53 получается P 0-GGFβ3; Trp53^+/- у мышей развиваются MPNST de novo, как это наблюдается у цис-Nf1^+/-; Trp53^+/- мыши.

Эти MPNST повторяют прогрессирование от II степени Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) к поражениям IV степени ВОЗ, наблюдаемым у людей⁷. У мышей P 0-GGFβ3 MPNST возникают в пределах ранее существовавших плексиформных нейрофибром в тройничном нерве (58%) и спинномозговых спинных нервных корешках (68%)⁷; MPNST, возникающие в P 0-GGFβ3; Trp53^+/- мыши имеют очень похожее распределение. У людей MPNST чаще всего возникают в седалищном нерве, за которым следуют плечевое сплетение, спинномозговые нервные корешки, блуждающие, бедренные, срединные, крестцовые сплетения, подколенный обтуратор и задний большеберцовый и локтевой нервы⁸. Это распределение опухолей в этих моделях GEM несколько отличается от того, что наблюдается у людей. Однако MPNST, которые возникают в P 0-GGFβ3 и P_0-GGFβ3; Trp53^+/- мыши гистологически идентичны человеческим MPNST, несут многие из тех же мутаций, которые наблюдаются у людей MPNST, и повторяют процесс прогрессирования нейрофибромы-MPNST, наблюдаемый у пациентов с NF1. Генерация P 0-GGFβ3 или P_0-GGFβ3; Trp53^+/- мыши, которые были Erbb4^-/- были невозможны, так как мыши с двумя нулевыми аллелями Erbb4 умирают в утробе матери на эмбриональном дне 10,5, вторичном по отношению к порокам сердца⁹. Поскольку спасение экспрессии Erbb4 в сердце путем введения кардиоспецифического трансгена Erbb4 (тяжелая цепь α-миозина (MHC)-Erbb4) приводит к жизнеспособным мышам Erbb4^-/-mice¹⁰, генерации мышей со сложным P 0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Была предпринята попытка генотипа Erbb4^-/-.

Тем не менее, спаривания не производили мышей в ожидаемых менделевских соотношениях, что указывает на то, что желаемый генотип был вредным. Поэтому генерация P 0-GGFβ3; Trp53^+/- мыши с флокированными аллелями Erbb4 ¹¹ и драйвером CreER^T2 были предприняты, чтобы разрешить удаление Erbb4 в MPNST, возникающих у этих мышей. У этих животных все еще присутствовали многочисленные опухолевые клетки с интактными аллелями Erbb4 (мозаицизм). Наблюдаемый мозаицизм может быть результатом неэффективной доставки тамоксифена, что привело к различиям в эффективности рекомбинации в ткани. Возможность спонтанных компенсаторных механизмов может еще больше способствовать мозаицизму в тамоксифен-опосредованной рекомбинации, минуя требование экспрессии Erbb4. Вполне возможно, что потеря Trp53 делает опухолевые клетки восприимчивыми к дополнительным спонтанным «разрешающим» мутациям, которые могут запутать интерпретацию данных. Поскольку казалось вероятным, что Erbb4-интактные MPNST-клетки будут маскировать последствия абляции Erbb4 в других опухолевых клетках, от этого подхода отказались.

Эти препятствия привели к разработке методологии абляции Erbb4 в очень раннем прохождении клеток MPNST с использованием аденовируса, экспрессирующего cre-рекомбиназу и eGFP. Эти клетки могут быть отделены от неинфицированных клеток с помощью FACS, что заметно снижает мозаицизм для абляционного гена Erbb4 . Ниже описаны методы, используемые для достижения этого, вместе с методами, используемыми для оценки эффектов абляции генов in vitro и in vivo. Следующий протокол является примером того, как производить опухоленосных мышей, которые дают опухоли, несущие флокированные аллели эмбриональных летальных генов, представляющих интерес для иссечения ex vivo до оценки роста опухоли аллотрансплантата in vivo . Это включает в себя описание подходов, используемых для анализа эффекта, который абляция Erbb4 оказывает на пролиферацию опухолевых клеток, выживаемость и экспрессию генов in vitro и пролиферацию, выживаемость и ангиогенез в ортотопических аллотрансплантатах.

Protocol

Прежде чем выполнять какие-либо процедуры с мышами, все процедуры должны быть рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Протокол, описанный в этой рукописи, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использов?…

Representative Results

Фиг.4 иллюстрирует типичный результат, полученный при преобразователе P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Клетки Erbb4fl/fl MPNST с аденовирусом Ad5CMV-eGFP или аденовирусом Ad5CMV-Cre/eGFP (рисунок 4A). Культуры рассматриваются с помощью флуоресцентной микроскопии д?…

Discussion

Подробные методы, представленные здесь, были разработаны с использованием gem модели MPNST. Однако, если интересующая опухолевая ткань может быть рассеяна в отдельных клетках, эти методологии легко адаптируются для различных типов опухолей, возникающих в GEMs. Важно убедиться, что флокирова…

Materials

Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA