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Neurociência

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

Abstract

Dans les neurones, l’orientation des microtubules a été un évaluateur clé pour identifier les axones qui ont des microtubules à extrémité plus et des dendrites qui ont généralement une orientation mixte. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. À l’aide de rapporteurs fluorescents génétiquement codés des pointes de microtubules, nous avons imagé les microtubules axonaux. Les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole. Ce test est adaptable à d’autres neurones et arrière-plans génétiques pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires.

Introduction

Les neurones ont une architecture élaborée avec des compartiments spécialisés comme les dendrites, les corps cellulaires, les axones et les synapses. Le cytosquelette neuronal est constitué des microtubules, microfilaments et neurofilaments et leur organisation distincte soutient structurellement et fonctionnellement les compartiments neuronaux1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Au fil des ans, l’organisation des microtubules a été identifiée comme un déterminant clé de la polarité et de la fonction neuronales. Au fur et à mesure que les neurones subissent un remodelage structurel au cours du développement ou de la régénération, la dynamique et l’orientation des microtubules déterminent l’identité, le transport polarisé, la croissance et le développement de divers compartiments neuronaux7. Il est donc impératif d’évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules in vivo pour établir une corrélation avec le processus de remodelage neuronal.

Les microtubules sont composés de protofilaments de α et d’hétérodimères de β de tubuline avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités moins relativement stables11,12. La découverte du complexe plus tip et des protéines de liaison aux extrémités associées a permis à une plateforme d’évaluer l’organisation des microtubules13. Les protéines de liaison finale (EBP) s’associent transitoirement aux extrémités plus en croissance du microtubule et leur dynamique d’association sont corrélées à la croissance des protofilaments du microtubule14,15. En raison de l’association et de la dissociation fréquentes du complexe de pointe plus avec le microtubule, la fonction d’étalement ponctuel de l’EBP marqué GFP apparaît comme une « comète » dans un film timelapse15,16. Depuis l’observation pionnière dans les neurones des mammifères16,les protéines de liaison d’extrémité marquées avec des protéines fluorescentes ont été utilisées pour déterminer la dynamique des microtubules à travers différents systèmes modèles et types de neurones17,18 , 19,20,21,22,23.

En raison de son système nerveux simple et de son corps transparent, C. elegans s’est avéré être un excellent système modèle pour étudier le remodelage neuronal pendant le développement et la régénération in vivo. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. En utilisant EBP-2::GFP génétiquement codé, nous avons imagé les microtubules dans le neurone PLM, ce qui nous a permis de déterminer la polarité des microtubules dans deux neurites différents de ce neurone24. Cette méthode permet l’observation et la quantification des comètes EBP comme mesure de la dynamique des microtubules dans différents contextes cellulaires, par exemple, les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être évalués à l’aide de notre protocole. Ce test peut être adapté pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires dans divers types de cellules et de milieux génétiques.

Protocol

1. Souche du rapporteur : Culture et entretien REMARQUE: Pour mesurer la dynamique et l’orientation des microtubules dans les neurones PLM, nous avons utilisé la souche de ver exprimant EBP-2::GFP sous le promoteur spécifique du neurone tactile mec-4 (allèlejuIs338) 18,25,26. Nous utilisons des méthodes standard de culture et d’entr…

Representative Results

À titre d’exemple représentatif, nous avons décrit l’observation in vivo des comètes EBP à l’état d’équilibre et des axones régénérants des neurones PLM. Les neurones PLM sont situés dans la région de la queue du ver avec un long processus antérieur qui forme une synapse et un court processus postérieur. Les neurones PLM se développent dans la direction antérieure-postérieure près de l’épiderme et sont responsables de la sensation de toucher doux chez les vers. En raison de leur structure sim…

Discussion

La compréhension de la dynamique des microtubules a été un objectif clé dans le domaine de la recherche sur le cytosquelette au fil des ans. Les microtubules subissent une nucléation et une catastrophe ainsi qu’un processus continu d’instabilité dynamique44,45,46,47. Une grande partie de cette information a été obtenue par des essais in vitro tels que de…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Yishi Jin et Andrew Chisholm pour le soutien initial et la souche utilisée dans l’étude. La souche bactérienne OP50 a été utilisée commercialement par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous remercions également Dharmendra Puri pour la standardisation des procédures expérimentales. L’étude est financée par la subvention de base du National Brain Research Centre (soutenu par le Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Subvention # IA / E / 18/1/504331) à S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Subvention # IA / I / 13/1/500874) à A.G.-R et une subvention du Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) à A.G.-R.

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
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Keywords: Microtubule DynamicsMicrotubule OrientationCaenorhabditis Elegans NeuronsIn Vivo AssessmentCytoskeletonAlpha And Beta TubulinEnd-binding ProteinsEBP-2GFPPLM NeuronsMake-3 PromoterMountingPolystyrene BeadsFluorescence MicroscopySpinning Disk Unit
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Citar este artigo
Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
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