È stato presentato un protocollo per l’imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.
Nei neuroni, l’orientamento dei microtubuli è stato un valutatore chiave per identificare gli assoni che hanno microtubuli e dendriti plus-end che generalmente hanno un orientamento misto. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificati di punte di microtubuli, abbiamo ripreso i microtubuli assonali. I cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l’assotomia possono essere quantificati utilizzando questo protocollo. Questo test è adattabile ad altri neuroni e background genetici per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari.
I neuroni hanno un’architettura elaborata con compartimenti specializzati come dendriti, corpi cellulari, assoni e sinapsi. Il citoscheletro neuronale è costituito dai microtubuli, microfilamenti e neurofilamenti e la loro organizzazione distinta supporta i compartimenti neuronali strutturalmente e funzionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Nel corso degli anni, l’organizzazione dei microtubuli è stata identificata come un determinante chiave della polarità e della funzione neuronale. Mentre i neuroni subiscono un rimodellamento strutturale durante lo sviluppo o la rigenerazione, la dinamica e l’orientamento dei microtubuli determinano l’identità, il trasporto polarizzato, la crescita e lo sviluppo di vari compartimenti neuronali7. È quindi imperativo valutare la dinamica dei microtubuli e l’orientamento in vivo per correlarsi con il processo di rimodellamento neuronale.
I microtubuli sono composti da protofilamenti di eterodimeri di α e β tubulina con estremità più dinamiche e estremità meno relativamente stabili11,12. La scoperta del complesso plus tip e delle proteine leganti l’estremità associate hanno permesso una piattaforma per valutare l’organizzazione dei microtubuli13. Le proteine leganti l’estremità (EBP) si associano transitoriamente alle estremità più crescenti del microtubulo e le loro dinamiche di associazione sono correlate alla crescita dei protofilamenti dei microtubuli14,15. A causa della frequente associazione e dissociazione del complesso plus tip con il microtubulo, la funzione di diffusione puntuale dell’EBP con tag GFP appare come una “cometa” in un film timelapse15,16. Dall’osservazione pionieristica nei neuroni dei mammiferi16,le proteine leganti le estremità marcate con proteine fluorescenti sono state utilizzate per determinare la dinamica dei microtubuli in diversi sistemi modello e tipi di neuroni17,18, 19,20,21,22,23.
Grazie al suo semplice sistema nervoso e al corpo trasparente, C. elegans ha dimostrato di essere un eccellente sistema modello per studiare il rimodellamento neuronale durante lo sviluppo e la rigenerazione in vivo. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando EBP-2::GFP geneticamente codificato, abbiamo ripreso i microtubuli nel neurone PLM, che ci ha permesso di determinare la polarità dei microtubuli in due diversi neuriti di questo neurone24. Questo metodo consente l’osservazione e la quantificazione delle comete EBP come misura della dinamica dei microtubuli in diversi contesti cellulari, ad esempio, i cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l’assotomia possono essere valutati utilizzando il nostro protocollo. Questo test può essere adattato per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari in diversi tipi di cellule e background genetici.
La comprensione della dinamica dei microtubuli è stata un obiettivo chiave nel campo della ricerca citoscheletrica nel corso degli anni. I microtubuli subiscono nucleazione e catastrofe insieme a un processo continuo di instabilità dinamica44,45,46,47. Molte di queste informazioni sono state ottenute attraverso saggi in vitro come le lettura di diffusione della lu…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Yishi Jin e Andrew Chisholm per il supporto iniziale e il ceppo utilizzato nello studio. Il ceppo batterico OP50 è stato utilizzato commercialmente dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Ringraziamo anche Dharmendra Puri per la standardizzazione delle procedure sperimentali. Lo studio è finanziato dalla sovvenzione principale del National Brain Research Centre (supportato dal Dipartimento di Biotecnologie, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1 / 504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1 / 500874) ad A.G.-R e una sovvenzione dal Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) ad A.G.-R.
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |