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Neurociência

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

Abstract

뉴런에서, microtubule 방향은 일반적으로 혼합 된 방향을 가지고 플러스 엔드 마이크로 투부와 원점축이 축축을 식별하는 주요 평가자되었습니다. 여기서는 C. elegans의 터치 뉴런의 개발 및 재생 중에 마이크로튜블러 역학 및 성장에 라벨, 이미지 및 분석을 하는 방법을 설명합니다. 마이크로 투덜르 팁의 유전적으로 인코딩 된 형광 기자를 사용하여 축축한 마이크로 투벌을 이미지했습니다. 축 절 에 따라 축 축 재생을 시작 하는 microtubule 동작에 로컬 변경 이 프로토콜을 사용 하 여 정량화될 수 있습니다. 이 분석은 다른 뉴런과 유전 적 배경에 적응하여 다양한 세포 프로세스에서 미세 tubule 역학의 조절을 조사할 수 있습니다.

Introduction

뉴런은 수상월리, 세포 몸, 축축및 시냅스와 같은 특수 구획을 갖춘 정교한 아키텍처를 가지고 있습니다. 신경 세포골격은 마이크로투블러, 마이크로필라멘트 및 신경필라멘트 및 그들의 뚜렷한 조직이 구조적이고 기능적으로 신경 구획을 지원하며,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 수년에 걸쳐, microtubule 조직은 신경 극성 및 기능의 중요한 결정요인으로 확인되었습니다. 뉴런이 개발 또는 재생 중에 구조적 리모델링을 거치면서, 마이크로튜블러 역학 및 방향은 다양한 뉴런 구획의 정체성, 편광 된 수송, 성장 및 개발을 결정한다7. 따라서 생체 내에서 마이크로튜블러 역학 및 방향을 평가하여 신경 리모델링 과정과 상관관계를 맺는 것이 필수적입니다.

마이크로투볼은 α 프로토필라멘트로 구성되며, β 튜부린 이종수와 다이내믹 플러스 엔드, 비교적 안정적인 마이너스 종료11,12로구성된다. 플러스 팁 복잡하고 관련 엔드 결합 단백질의 발견은 마이크로 튜블러 조직을 평가하는 플랫폼을가능하게했다(13). 최종 결합 단백질(EBP)은 마이크로튜블러및 이들의 결합 역학의 성장 플러스 엔드와 과도하게 연관되어14,15의마이크로튜블 프로토필라멘트의 성장과 상관된다. 마이크로튜비를 가진 플러스 팁 컴플렉스의 빈번한 연관성 및 해리로 인해, GFP 태그EBP의 포인트 확산 기능은 타임랩스 영화15,16에서“혜성”으로 나타난다. 포유류뉴런(16)에서의 선구적인 관찰 이후, 형광 단백질로 태그된 엔드 결합 단백질은 상이한 모델 시스템 및 뉴런유형(17,18,19,20,21,22, 23)에걸쳐 미세투포역학을 결정하는 데 사용되어 왔다.

단순 신경계와 투명한 신체로 인해 C. elegans는 생체 내에서 개발 및 재생 중에 신경 리모델링을 연구하는 우수한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 여기서는 C. elegans의 터치 뉴런의 개발 및 재생 중에 마이크로튜블러 역학 및 성장에 라벨, 이미지 및 분석을 하는 방법을 설명합니다. 유전적으로 인코딩된 EBP-2:GFP를 사용하여 PLM 뉴런의 마이크로튜블을 이미지화하여 이 뉴런24의두 가지 다른 중성염에서 마이크로투블러의 극성을 확인할 수 있었습니다. 이 방법은 다양한 세포 컨텍스트에서 미세 tubule 역학의 척도로서 EBP 혜성의 관찰 및 정량화를 허용하며, 예를 들어 축절 다음 축축전을 시작하는 미세 투벌 동작의 국소 변화는 우리의 프로토콜을 사용하여 평가될 수 있습니다. 이 분석은 다양한 세포 유형 및 유전 배경에서 다양한 세포 과정에서 미세 tubule 역학의 조절을 조사하기 위해 적응 될 수있다.

Protocol

1. 리포터 변형: 문화 및 유지 보수 참고: PLM 뉴런에서 마이크로튜블 역학 및 방향을 측정하기 위해, 우리는 EBP-2::GFP를 발현하는 웜 스트레인을 사용하여 터치 뉴런 특이성 프로모터 mec-4(juIs338 allele)18,25,26을사용했다. 우리는이 균주(27)에대한 …

Representative Results

대표적인 예로, 우리는 PLM 뉴런의 정상 상태 및 재생 축록에서 EBP 혜성의 생체 관측에 설명했다. PLM 뉴런은 시냅스와 짧은 후방 과정을 형성하는 긴 전방 과정을 가진 웜의 꼬리 영역에 위치하고 있습니다. PLM 뉴런은 표피에 가까운 전방 후방 방향으로 성장하고 벌레의 부드러운 터치 감각에 대한 책임이 있습니다. 그들의 단순화된 구조, 및 화상 진찰 및 미세 수술에 대한 편의성으로 인해 PLM 뉴런…

Discussion

미세 tubule 역학을 이해하는 것은 수년에 걸쳐 사이토스켈레탈 연구 분야에서 중요한 초점이었습니다. 마이크로튜블러는44,45,46,47의연속적인 과정과 함께 핵형성 및재앙을겪는다. 이러한 정보의 대부분은 무료 대 중합관, 형광 튜룰린 등의 마이크로투룰 성장 아스약과 같은 체외…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이시진과 앤드류 치스홀름에게 초기 지원과 연구에 사용된 균주에 감사드립니다. 세균균 균주 OP50은 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)에 의해 투자 된 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 상업적으로 이용되었습니다. 우리는 또한 실험 절차의 표준화에 대한 Dharmendra Puri감사합니다. 이 연구는 국립 뇌 연구 센터 (생명 공학부, 인도 정부의 지원), DBT / 웰컴 트러스트 인디아 얼라이언스 초기 경력 보조금 (그랜트 # IA / E / 18/1/504331)에서 S.D., Wellcome Trust-DBT 인도 얼라이언스 중간 보조금 (그랜트 # IA / I/13/1/500874)의 핵심 보조금에 의해 지원됩니다. CRG/2019/002194)에서 A.G.-R까지

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
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Keywords: Microtubule DynamicsMicrotubule OrientationCaenorhabditis Elegans NeuronsIn Vivo AssessmentCytoskeletonAlpha And Beta TubulinEnd-binding ProteinsEBP-2GFPPLM NeuronsMake-3 PromoterMountingPolystyrene BeadsFluorescence MicroscopySpinning Disk Unit
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Citar este artigo
Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
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