JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Neurociência

In vivo Vurdering av mikrotubul dynamikk og orientering i Caenorhabditis elegans Neurons

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

En protokoll for avbildning av de dynamiske mikrotubulene in vivo ved hjelp av fluorescerende merket End bindingsprotein har blitt presentert. Vi beskrev metodene for å merke, bilde og analysere de dynamiske mikrotubulene i Posterior lateral microtubule (PLM) neuron av C. elegans.

Abstract

I nevroner har mikrotubul orientering vært en viktig takstmann for å identifisere axoner som har pluss-end ut mikrotubuler og dendritter som generelt har blandet orientering. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende reportere av mikrotubule tips, avbildet vi de axonale mikrotubulene. De lokale endringene i mikrotubul oppførsel som starter axon regenerering etter axotomi kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen. Denne analysen er tilpasningsdyktig til andre nevroner og genetisk bakgrunn for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser.

Introduction

Nevroner har en forseggjort arkitektur med spesialiserte rom som dendritter, cellelegemer, axoner og synapser. Den nevronale cytoskjelettet består av mikrotubuler, mikrofilamenter og nevrofilamenter, og deres distinkte organisasjon støtter nevronrommene strukturelt og funksjonelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Gjennom årene har mikrotubul organisasjon blitt identifisert som en nøkkeldeterminant for nevronal polaritet og funksjon. Når nevroner gjennomgår strukturell ombygging under utvikling eller regenerering, bestemmer mikrotubuldynamikken og orienteringen identiteten, polarisert transport, vekst og utvikling av ulike nevronrom7. Det er derfor viktig å vurdere mikrotubuldynamikken og orienteringsinvoen for å korrelere med den nevronale ombyggingsprosessen.

Mikrotubuler består av protofilaments av α og β Tubulin heterodimers med dynamiske pluss ender og relativt stabile minus ender11,12. Oppdagelsen av plussspisskomplekset og tilhørende sluttbindingsproteiner har gjort det mulig for en plattform å vurdere mikrotubuleorganisasjonen13. Sluttbindingsproteiner (EBP) forbigående forbinder med de voksende pluss endene av mikrotubulen, og deres assosiasjonsdynamikk er korrelert med veksten av mikrotubule-protofilamentene14,15. På grunn av hyppig assosiasjon og dissosiasjon av plussspisskompleks med mikrotubulen, vises punktspredningsfunksjonen til GFP-merket EBP som en “komet” i en timelapse-film15,16. Siden den banebrytende observasjonen i pattedyr nevroner16, sluttbinding proteiner merket med fluorescerende proteiner har blitt brukt til å bestemme mikrotubule dynamikken på tvers av ulike modellsystemer og neuron typer17,18,19,20,21,22,23.

På grunn av sitt enkle nervesystem og gjennomsiktige kropp har C. elegans vist seg å være et utmerket modellsystem for å studere nevronal ombygging under utvikling og regenerering in vivo. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodet EBP-2::GFP, avbildet vi mikrotubulene i PLM-nevronen, noe som tillot oss å bestemme mikrotubulens polaritet i to forskjellige neuritter i denne nevron24. Denne metoden tillater observasjon og kvantifisering av EBP-kometene som et mål på mikrotubuldynamikk i forskjellige cellulære sammenhenger, for eksempel kan de lokale endringene i mikrotubuladferd som initierer axonregenerering etter axotomi vurderes ved hjelp av vår protokoll. Denne analysen kan tilpasses for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser i ulike celletyper og genetisk bakgrunn.

Protocol

1. Reporter belastning: Kultur og vedlikehold MERK: For å måle mikrotubuldynamikken og orienteringen i PLM-nevronene brukte vi ormstammen som uttrykte EBP-2::GFP under berøring nevronspesifikk promotor mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. Vi bruker standard ormkultur og vedlikeholdsmetoder for denne stammen27. …

Representative Results

Som et representativt eksempel har vi beskrevet in vivo observasjon av EBP-kometene i steady-state og regenererende axoner av PLM-nevronene. PLM-nevroner ligger i haleområdet av ormen med en lang fremre prosess som danner en synapse og en kort bakre prosess. PLM-nevroner vokser i den fremre bakre retningen nær epidermis og er ansvarlige for den milde berøringsfølelsen i ormene. På grunn av deres forenklede struktur, og egnethet til avbildning og mikrokirurgi, har PLM-nevroner blitt grundig undersøkt for deres mikro…

Discussion

Å forstå mikrotubuldynamikken har vært et sentralt fokus innen cytoskeletal forskning gjennom årene. Mikrotubuler gjennomgår kjernedannelse og katastrofe sammen med en kontinuerlig prosess med dynamisk ustabilitet44,45,46,47. Mye av denne informasjonen er oppnådd gjennom in vitro-analyser som lysspredningsavlesninger av fri vs polymerisert tubulin, mikrotubul …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Yishi Jin og Andrew Chisholm for den første støtten og belastningen som ble brukt i studien. Bakteriestammen OP50 ble kommersielt benyttet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi takker også Dharmendra Puri for standardiseringen av eksperimentelle prosedyrer. Studien er finansiert av kjernestipendet til National Brain Research Centre (støttet av Institutt for bioteknologi, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1/504331) til S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1/500874) til A.G.-R og et stipend fra Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) til A.G.-R.

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Keywords: Microtubule DynamicsMicrotubule OrientationCaenorhabditis Elegans NeuronsIn Vivo AssessmentCytoskeletonAlpha And Beta TubulinEnd-binding ProteinsEBP-2GFPPLM NeuronsMake-3 PromoterMountingPolystyrene BeadsFluorescence MicroscopySpinning Disk Unit
check_url/pt/62744?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image