JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

In vivo Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.

Abstract

В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.

Introduction

Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжении многих лет организация микротрубочек была идентифицирована как ключевой детерминант полярности и функции нейронов. Поскольку нейроны подвергаются структурному ремоделированию во время развития или регенерации, динамика и ориентация микротрубочек определяют идентичность, поляризованный транспорт, рост и развитие различных нейронных компартментов7. Поэтому крайне важно оценить динамику и ориентацию микротрубочек in vivo, чтобы коррелировать с процессом ремоделирования нейронов.

Микротрубочки состоят из протофиламентов гетеродимеров α и β тубулина с динамическими плюс-концами и относительно стабильными минус-концами11,12. Открытие комплекса плюс-наконечника и связанных с ним конечных связывающих белков позволило платформе оценить организацию микротрубочек13. Конечные связывающие белки (EBP) временно связываются с растущими плюс концем микротрубочек и их ассоциативная динамика коррелирует с ростом протофиламентов микротрубочек14,15. Из-за частой ассоциации и диссоциации комплекса плюс наконечника с микротрубочкой функция точечного распространения GFP-помеченного EBP появляется как «комета» в таймлапс-ролике15,16. Начиная с новаторского наблюдения за нейронами млекопитающих16,конечные связывающие белки, помеченные флуоресцентными белками, использовались для определения динамики микротрубочек в различных модельных системах и типах нейронов17,18,19,20,21,22,23.

Благодаря своей простой нервной системе и прозрачному телу, C. elegans зарекомендовал себя как отличная модельная система для изучения ремоделирования нейронов во время развития и регенерации in vivo. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированный EBP-2::GFP, мы визуализировали микротрубочки в нейроне PLM, что позволило нам определить полярность микротрубочек в двух разных нейритах этого нейрона24. Этот метод позволяет наблюдать и количественно оценивать кометы EBP как меру динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, например, локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть оценены с использованием нашего протокола. Этот анализ может быть адаптирован для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах в различных типах клеток и генетическом фоне.

Protocol

1. Репортерное напряжение: культура и поддержание ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения динамики микротрубочек и ориентации в нейронах PLM мы использовали штамм червя, экспрессирующий EBP-2::GFP под сенсорным нейроном специфическим промотором mec-4 (аллель juIs338) <…

Representative Results

В качестве репрезентативного примера мы описали наблюдение in vivo комет EBP в стационарном состоянии и регенерирующими аксонами нейронов PLM. PLM-нейроны расположены в хвостовой области червя с длинным передним отроском, образующий синапс и короткий задний отроск. Нейроны PLM растут в передн?…

Discussion

Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,<sup c…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (грант No IA/I/13/1/500874) для A.G.-R и гранта От Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB: CRG/2019/002194) для A.G.-R.

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Keywords: Microtubule DynamicsMicrotubule OrientationCaenorhabditis Elegans NeuronsIn Vivo AssessmentCytoskeletonAlpha And Beta TubulinEnd-binding ProteinsEBP-2GFPPLM NeuronsMake-3 PromoterMountingPolystyrene BeadsFluorescence MicroscopySpinning Disk Unit
check_url/pt/62744?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image