Ett protokoll för avbildning av de dynamiska mikrotubulerna in vivo med fluorescerande märkt End bindande protein har presenterats. Vi beskrev metoderna för att märka, bild och analysera de dynamiska mikrotubulerna i bakre laterala microtubule (PLM) neuron av C. elegans.
I nervceller har microtubule orientering varit en viktig bedömare för att identifiera axoner som har plus-end ut mikrotubuler och dendriter som i allmänhet har blandad orientering. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande reportrar av mikrotubulespetsar avbildade vi de axonal mikrotubulerna. De lokala förändringarna i mikrotubule beteende som initierar axon regenerering efter axotomy kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Denna analys är anpassningsbar till andra nervceller och genetiska bakgrunder för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer.
Neuroner har en utarbetad arkitektur med specialiserade fack som dendriter, cellkroppar, axoner och synapser. Neuronal cytoskeleton består av mikrotubuler, mikrofilament och neurofilament och deras distinkta organisation stöder neuronala fack strukturellt och funktionellt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Under årens lopp har microtubule organisation identifierats som en viktig determinant för neuronal polaritet och funktion. Eftersom nervceller genomgår strukturell ombyggnad under utveckling eller regenerering bestämmer mikrotubuledynamiken och orienteringen identiteten, polariserade transporter, tillväxt och utveckling av olika neuronala fack7. Det är därför absolut nödvändigt att bedöma mikrotubuledynamiken och orienteringen in vivo för att korrelera med den neuronala ombyggnadsprocessen.
Mikrotubuler består av protofilament av α och β Tubulin heterodimers med dynamiska plusändar och relativt stabila minus ändar11,12. Upptäckten av plusspetskomplexet och tillhörande slutbindande proteiner har gjort det möjligt för en plattform att bedöma mikrotubuleorganisationen13. Slutbindande proteiner (EBP) associeras tillfälligt med mikrotubuleens växande plusändar och deras associationsdynamik korreleras till tillväxten av mikrotubuleprotofilamenten14,15. På grund av frekvent association och dissociation av plusspetskomplex med mikrotubule visas punktspridningsfunktionen för GFP-märkt EBP som en “komet” i en timelapse-film15,16. Sedan den banbrytande observationen i däggdjursneuroner16, har slutbindande proteiner märkta med fluorescerande proteiner använts för att bestämma mikrotubuledynamiken i olika modellsystem och neurontyper17,18,19,20,21,22,23.
På grund av sitt enkla nervsystem och transparenta kropp har C. elegans visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att studera neuronal ombyggnad under utveckling och regenerering in vivo. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade EBP-2::GFP, vi avbildade mikrotubulerna i PLM-neuron, vilket gjorde det möjligt för oss att bestämma polariteten hos mikrotubulerna i två olika neuriter av denna neuron24. Denna metod möjliggör observation och kvantifiering av EBP-kometer som ett mått på mikrotubuledynamik i olika cellulära sammanhang, till exempel kan de lokala förändringarna i mikrotubulebeteende som initierar axonregenerering efter axotomi bedömas med hjälp av vårt protokoll. Denna analys kan anpassas för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer i olika celltyper och genetiska bakgrunder.
Att förstå mikrotubuledynamiken har varit ett centralt fokus inom området cytoskeletal forskning genom åren. Mikrotubuler genomgår nukleation och katastrof tillsammans med en kontinuerlig process av dynamisk instabilitet44,45,46,47. Mycket av denna information har erhållits genom in vitro-analyser som ljusspridningsutläsningar av fritt vs polymeriserat tubuli…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yishi Jin och Andrew Chisholm för det initiala stödet och den stam som används i studien. Bakteriestammen OP50 utnyttjades kommersiellt från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi tackar också Dharmendra Puri för standardiseringen av de experimentella förfarandena. Studien finansieras genom kärnbidrag från National Brain Research Centre (med stöd av Institutionen för bioteknik, Govt. av Indien), DBT/Wellcome förtroende Indien allians tidig sortkarriärbidrag (anslag # IA/E/18/1/504331) till S.D., Wellcome förtroende-DBT Indien allians intermediate anslag (anslag # IA/I/13/1/500874) till A.G.-R och ett anslag från vetenskap och iscensätta forskningsnämnden (SERB: CRG/2019/002194) till A.G.-R.
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |