قياسات نقل الطاقة الرنين Förster في الخلايا النباتية الحية
Summary
يتم توفير بروتوكول لإعداد مجهر مسح ليزر كونفوكوكال قياسي لقياسات نقل الطاقة بالرنين في الجسم الحي Förster ، يليه تقييم البيانات.
Abstract
تتم بسهولة تجارب نقل الطاقة بالرنين الرنيني (FRET) القائمة على الانبعاثات ولكن تعتمد على الإعداد المجهري. أصبحت مجاهر المسح بالليزر Confocal العمود الفقري لعلماء الأحياء. توفر الأنظمة التجارية مرونة عالية في ضبط طاقة الليزر وحساسية الكاشف وغالبا ما تجمع بين أجهزة الكشف المختلفة للحصول على الصورة المثالية. ومع ذلك، غالبا ما تكون مقارنة البيانات المستندة إلى الكثافة من التجارب والإعدادات المختلفة مستحيلة بسبب هذه المرونة. تعد الإجراءات الصديقة لعلماء الأحياء ذات فائدة وتسمح بتعديل بسيط وموثوق به لإعدادات الليزر والكاشف.
وعلاوة على ذلك، بما أن تجارب FRET في الخلايا الحية تتأثر بالتباين في التعبير عن البروتين ونسب قبول المانحين، يجب النظر في مستويات التعبير عن البروتين لتقييم البيانات. وصف هنا هو بروتوكول بسيط لقياسات FRET موثوق بها وقابلة للاستنساخ، بما في ذلك إجراءات لتقدير التعبير البروتين وتعديل كثافة الليزر وإعدادات كاشف. سيتم إجراء تقييم البيانات عن طريق المعايرة مع دمج الفلوروفور من كفاءة FRET المعروفة. لتحسين البساطة، تمت مقارنة عوامل التصحيح التي تم الحصول عليها في الخلايا وقياس البروتينات الفلورية المؤتلفة.
Introduction
عادة ما يلاحظ نقل الطاقة بالرنين Förster ((F)RET) عن طريق التحليل الطيفي الفلوري ، على الرغم من أن العملية نفسها لا تقتصر على الحدوث بين الفلوروفوريس. اقتران ثنائي القطب الكامنة ببساطة يتطلب جزيء المانحة الباعثة للضوء ومقبول امتصاص الضوء. وهذا مستمد من التداخل الطيفي المطلوب الذي لا يتجزأ من J من أطياف امتصاص الانبعاثات والمتقبلات العادية للمانحين1. ومع ذلك، ولأن تكنولوجيا الطاقة المتجددة تتنافس مع الفلورسينس، يصبح نقل الطاقة قابلا للقياس من خلال التعديلات في انبعاثات الفلورية: تحفز الطاقة المتجددة على إخماد المانحين وانبعاثات المقبولين الحساسة.
وقد أطلق على تكنولوجيا الطاقة المتجددة القائمة على الفلوروفور (RET) مصطلح نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لفصله عن نقل الطاقة بالرنين الإضاءة الحيوية (BRET). تعتمد تكنولوجيا الطاقة المتجددة بقوة على المسافة بين المتبرع والمقبل، والتي تقع على نطاق واسع في نطاق 0.5-10 نانومتر مربع ، وبالتالي، في نفس نطاق أبعاد البروتينات ومجمعاتها. ثانيا، يعتمد RET على ثنائي القطب التوجه كابا التربيعية. جنبا إلى جنب مع حقيقة أن حرية الدوران من الفلوروفوريس المرتبطة بالبروتين يمكن إهمالها بسبب الوزن الجزيئي والاسترخاء الدوراني البطيء ، تسمح RET بتحليل التعديلات التوافقية3.
ويستند ما يسمى دائرة نصف قطرها فورستر على التداخل الطيفي لا يتجزأ ونطاق الطول الموجي للتداخل، بحيث الكروموفوريس امتصاص الضوء الأحمر يؤدي إلى أطول Förster radii من الأصباغ الزرقاء امتصاص الضوء. نظرا لأن النطاق الديناميكي لقياسات FRET محدود بنسبة 0.5 × R0 و 1.5 × R0 ، فإن زوج FRET ECFP-EYFP لديه نطاق ديناميكي يتراوح بين 2.5-7.3 نانومتر بسبب R0 من 4.9 نانومتر4.
يتم إعطاء سطوع الفلوروفور من خلال نتاج معامل انقراض الضرس وغلته الكمية. بالنسبة لقياسات FRET ، من المفيد اختيار الفلوروفورات ذات السطوع المماثل تقريبا. وهذا يعزز الكشف عن إخماد المانحين وتوعية الانبعاثات المقبولة. كما أنه يفضل معايرة نظام المجهر. بالنظر إلى أزواج FRET المستخدمة بشكل متكرر من البروتينات السماوي والفلورسنت ، يصبح السطوع السفلي للبروتينات الفلورية السماوي واضحا (الشكل 1A).
ومع ذلك، يجب أن يكون عمر المقبول أقل من عمر المتبرع، مما يضمن توافر المقبول لنقل الطاقة. إذا تجاوزت مدة حياة المقبول عمر المتبرع ، فقد يكون المقبول لا يزال في حالة متحمسة عندما يكون المتبرع متحمسا مرة أخرى. تظهر البروتينات الفلورية السيان المتقدمة مثل mTurquoise عمرا ممتدا وبالتالي تساهم في زيادة احتمالية FRET (Figure1B). يعتمد احتمال FRET أيضا على معامل انقراض الضرس للمقبول.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتميز إخماد المانحين وانبعاثات المقبولين الحساسين بعلاقة خطية تسمح إما بحساب FRET القائم على المانح أو المقبول. وتسمى العوامل المقابلة للخطية إما عامل G (المانح للمقبل) أو الحادي عشر (المقبول للمتبرع)، وهما قيم متبادلة4. قياس FRET بين البروتينات الفلورية عن طريق المجهر الفلوري غ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجريت التجارب في منصة تكنولوجيا المجهر الخفيف (LiMiTec) التابعة لكلية البيولوجيا، جامعة بيليفيلد. وقد مولت جامعة بيليفيلد هذا العمل.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
Referências
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
