Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण जीवित संयंत्र कोशिकाओं में माप
Summary
विवो Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण माप में के लिए एक मानक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, डेटा मूल्यांकन के बाद।
Abstract
संवेदी उत्सर्जन आधारित Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) प्रयोगों आसानी से किया जाता है, लेकिन माइक्रोस्कोपिक सेटअप पर निर्भर करता है। Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप जीवविज्ञानियों के लिए एक workhorse बन गए हैं। वाणिज्यिक प्रणालियां लेजर पावर समायोजन और डिटेक्टर संवेदनशीलता में उच्च लचीलापन प्रदान करती हैं और अक्सर सही छवि प्राप्त करने के लिए विभिन्न डिटेक्टरों को जोड़ती हैं। हालांकि, विभिन्न प्रयोगों और सेटअपों से तीव्रता-आधारित डेटा की तुलना अक्सर इस लचीलेपन के कारण असंभव होती है। जीवविज्ञानी के अनुकूल प्रक्रियाएं लाभ की हैं और लेजर और डिटेक्टर सेटिंग्स के सरल और विश्वसनीय समायोजन के लिए अनुमति देती हैं।
इसके अलावा, चूंकि जीवित कोशिकाओं में FRET प्रयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति और दाता-स्वीकर्ता अनुपात में परिवर्तनशीलता से प्रभावित होते हैं, इसलिए डेटा मूल्यांकन के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर विचार किया जाना चाहिए। यहां वर्णित विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य FRET माप के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है, जिसमें प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुमान और लेजर तीव्रता और डिटेक्टर सेटिंग्स के समायोजन के लिए दिनचर्या शामिल है। डेटा मूल्यांकन ज्ञात FRET दक्षता के एक fluorophore संलयन के साथ अंशांकन द्वारा किया जाएगा। सादगी में सुधार करने के लिए, सुधार कारकों की तुलना की गई है जो कोशिकाओं में और पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को मापने के द्वारा प्राप्त किए गए हैं।
Introduction
Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण ((एफ) आरईटी) आमतौर पर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है, हालांकि प्रक्रिया स्वयं फ्लोरोफोरस के बीच होने तक सीमित नहीं है। अंतर्निहित द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय युग्मन को बस एक प्रकाश उत्सर्जक दाता अणु और एक प्रकाश-अवशोषित स्वीकर्ता की आवश्यकता होती है। यह आवश्यक वर्णक्रमीय ओवरलैप इंटीग्रल जे से प्राप्त होता है जो सामान्यीकृत दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा 1 का होता है। हालांकि, क्योंकि आरईटी प्रतिदीप्ति के साथ प्रतिस्पर्धा करता है, ऊर्जा हस्तांतरण प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन द्वारा औसत दर्जे का हो जाता है: आरईटी दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन को प्रेरित करता है।
फ्लोरोफोर-आधारित आरईटी को बायोल्यूमिनेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (BRET) से अलग करने के लिए प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) कहा जाता है। आरईटी दाता और स्वीकर्ता के बीच की दूरी पर दृढ़ता से निर्भर करता है, जो व्यापक रूप से 0.5-10 एनएम 2 की सीमा में है और इस प्रकार, प्रोटीन और उनके परिसरों के आयामों के समान सीमा में है। दूसरा, आरईटी द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय अभिविन्यास कप्पा वर्ग पर निर्भर करता है। इस तथ्य के साथ संयुक्त है कि प्रोटीन-बाध्य फ्लोरोफोरस की घूर्णी स्वतंत्रता को आणविक वजन और धीमी गति से घूर्णी विश्राम के कारण उपेक्षित किया जा सकता है, आरईटी संरचनात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है3।
तथाकथित Förster त्रिज्या वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न और ओवरलैप की तरंग दैर्ध्य सीमा पर आधारित है, ताकि लाल प्रकाश को अवशोषित क्रोमोफोर के परिणामस्वरूप नीले प्रकाश-अवशोषित रंगों की तुलना में लंबे समय तक फ़र्स्टर त्रिज्या हो। चूंकि FRET माप की गतिशील सीमा R0 × 0.5 और R0 × 1.5 द्वारा सीमित है, इसलिए FRET जोड़ी ECFP-EYFP में 4.9 nm4 के R0 के कारण 2.5-7.3 nm की गतिशील सीमा है।
फ्लोरोफोर की चमक इसके दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक और इसकी क्वांटम उपज के उत्पाद द्वारा दी जाती है। FRET माप के लिए, लगभग समान चमक के fluorophores का चयन करना फायदेमंद है। यह दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन का पता लगाने को बढ़ाता है। यह माइक्रोस्कोपी सिस्टम के अंशांकन का भी पक्षधर है। सियान और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अक्सर उपयोग किए जाने वाले FRET जोड़े को देखते हुए, सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कम चमक स्पष्ट हो जाती है (चित्रा 1 ए)।
हालांकि, स्वीकर्ता का जीवनकाल दाता के जीवनकाल से कम होना चाहिए, जिससे ऊर्जा हस्तांतरण के लिए स्वीकर्ता की उपलब्धता सुनिश्चित हो। यदि स्वीकर्ता का जीवनकाल दाता के जीवनकाल से अधिक है, तो स्वीकर्ता अभी भी उत्साहित अवस्था में हो सकता है जब दाता फिर से उत्साहित होता है। उन्नत सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे mTurquoise एक विस्तारित जीवनकाल दिखाते हैं और इस प्रकार FRET (चित्रा 1 B) की बढ़ी हुई संभावना में योगदान करते हैं। FRET की संभावना भी स्वीकर्ता के दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक पर निर्भर करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन को एक रैखिक संबंध की विशेषता है जो या तो दाता- या FRET के स्वीकर्ता-आधारित गणना के लिए अनुमति देता है। रैखिकता के संबंधित कारकों को या तो जी कारक (दाता से स्वीकर्ता)…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रयोगों को जीव विज्ञान संकाय, Bielefeld विश्वविद्यालय के लाइट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी मंच (LiMiTec) में किया गया था। इस काम को Bielefeld University द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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