Förster Resonance Energy Transfer Mätningar i levande växtceller
Summary
Ett protokoll tillhandahålls för att ställa in ett standardkonokalt laserskanningsmikroskop för in vivo Förster resonansenergiöverföringsmätningar, följt av datautvärdering.
Abstract
Sensibiliserade emissionsbaserade Fret-experiment (Förster resonance energy transfer) är lätta att göra men beror på den mikroskopiska installationen. Konfokala laserskanningsmikroskop har blivit en arbetshäst för biologer. Kommersiella system erbjuder hög flexibilitet i lasereffektjustering och detektorkänslighet och kombinerar ofta olika detektorer för att få den perfekta bilden. Jämförelsen av intensitetsbaserade data från olika experiment och inställningar är dock ofta omöjlig på grund av denna flexibilitet. Biologvänliga procedurer är till fördel och möjliggör enkel och tillförlitlig justering av laser- och detektorinställningar.
Eftersom FRET-experiment i levande celler påverkas av variabiliteten i proteinuttryck och donator-acceptor-förhållanden, måste dessutom proteinuttrycksnivåer beaktas för datautvärdering. Beskrivs här är ett enkelt protokoll för tillförlitliga och reproducerbara FRET-mätningar, inklusive rutiner för uppskattning av proteinuttryck och justering av laserintensitet och detektorinställningar. Datautvärderingen kommer att utföras genom kalibrering med en fluoroforfusion av känd FRET-effektivitet. För att förbättra enkelheten har korrigeringsfaktorer jämförts som har erhållits i celler och genom att mäta rekombinanta fluorescerande proteiner.
Introduction
Förster resonans energiöverföring ((F)RET) observeras vanligtvis av fluorescensspektroskopi, även om själva processen inte är begränsad till att inträffa mellan fluoroforer. Den underliggande dipol-dipolkopplingen kräver helt enkelt en ljusemitterande donatormolekyl och en ljusabsorberande acceptor. Detta härleds från den erforderliga spektral överlappning integrerad J av normaliserade givaren utsläpp och acceptor absorbans spektra1. Men eftersom RET konkurrerar med fluorescens blir energiöverföringen mätbar genom förändringar i fluorescensutsläpp: RET inducerar givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp.
Fluorofor-baserade RET har kallats fluorescens resonans energiöverföring (FRET) för att skilja den från bioluminescens resonans energiöverföring (BRET). RET beror starkt på avståndet mellan donator och acceptor, som ligger i stor utsträckning i intervallet 0,5-10 nm2 och därmed i samma intervall som dimensionerna av proteiner och deras komplex. För det andra beror RET på dipol-dipolorienterings orientering kappa kvadrat. I kombination med det faktum att rotationsfriheten hos proteinbundna fluoroforer kan försummas på grund av molekylvikten och den långsamma rotationsavslappningen, möjliggör RET analys av konformationsförändringar3.
Den så kallade Försterradien är baserad på den spektralöverlappande integralen och våglängdsområdet för överlappningen, så att röda ljusabsorberande kromoforer resulterar i längre Förster-radier än blå ljusabsorberande färgämnen. Eftersom det dynamiska intervallet för FRET-mätningar begränsas av 0,5 × R0 och 1,5 × R0, har FRET-paret ECFP-EYFP ett dynamiskt omfång på 2,5-7,3 nm på grund av dess R0 på 4,9 nm4.
Ljusstyrkan hos en fluorofor ges av produkten av dess molarutrotningskoefficient och dess kvantutbyte. För FRET-mätningar är det fördelaktigt att välja fluoroforer med nästan liknande ljusstyrka. Detta förbättrar upptäckten av givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp. Det gynnar också kalibreringen av mikroskopisystemet. Om man tittar på de ofta använda FRET-paren av cyan- och fluorescerande proteiner blir den lägre ljusstyrkan hos de cyan fluorescerande proteinerna uppenbar (figur 1A).
Acceptorns livstid måste dock vara lägre än givarens livslängd, vilket säkerställer att acceptorn är tillgänglig för energiöverföring. Om acceptorns livstid överskrider donatorns livstid kan acceptorn fortfarande vara i upphetsat tillstånd när donatorn är upphetsad igen. Avancerade cyan fluorescerande proteiner som mTurquoise visar en förlängd livslängd och bidrar därmed till en ökad sannolikhet för FRET (Figur1B). Sannolikheten för FRET beror också på acceptorns molarutrotningskoefficient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Givarsläckning och sensibiliserade acceptor utsläpp kännetecknas av ett linjärt förhållande som möjliggör antingen givaren- eller acceptorbaserad beräkning av FRET. Motsvarande linjäritetsfaktorer kallas antingen G-faktor (givare till acceptor) eller xi (acceptor till donator), som är ömsesidiga värden4. Mätning av FRET mellan fluorescerande proteiner genom fluorescensmikroskopi kräver ofta korrigeringar för DSBT och ASBT på grund av den breda absorptionen och emissionsspektra av …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Experimenten utfördes vid Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) vid fakulteten för biologi, Bielefeld University. Detta arbete har finansierats av Bielefeld University.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
Referências
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
