Denne protokol beskriver en procedure for konstruktion af kulfiber mikroelektrode arrays til kroniske og akutte in vivo elektrofysiologiske optagelser i mus (Mus musculus) og fritte (Mustela putorius furo) fra flere hjerneområder. Hvert trin, efter køb af rå kulfibre til mikroelektrode array implantation, er beskrevet i detaljer, med vægt på mikroelektrode array konstruktion.
Multikanal elektrode arrays giver indsigt i den arbejdende hjerne og tjener til at belyse neurale processer på encellede og kredsløb niveauer. Udvikling af disse værktøjer er afgørende for at forstå kompleks adfærd og kognition og for at fremme kliniske anvendelser. Det er dog fortsat en udfordring at registrere fra cellepopulationer stabilt og kontinuerligt over lange tidsperioder. Mange populære elektroder, såsom tetroder og silicium arrays, har store krydsdiametre, der producerer skader ved indsættelse og fremkalde kronisk reaktive vævsresponser forbundet med neuronal død, hindrer registrering af stabil, kontinuerlig neural aktivitet. Derudover udviser de fleste trådbundter bred afstand mellem kanaler, der udelukker samtidig optagelse fra et stort antal celler grupperet i et lille område. Kulfiber mikroelektrode arrays beskrevet i denne protokol tilbyder en tilgængelig løsning på disse bekymringer. Undersøgelsen giver en detaljeret metode til fremstilling af kulfiber mikroelektrode arrays, der kan bruges til både akutte og kroniske optagelser in vivo. De fysiske egenskaber af disse elektroder gør dem ideelle til stabile og kontinuerlige langsigtede optagelser ved høje celletætheder, hvilket gør det muligt for forskeren at lave robuste, utvetydige optagelser fra enkelte enheder på tværs af måneder.
Elektroder og elektrode arrays er værdifulde værktøjer til at forstå, hvordan hjernen behandler information på neuronalt niveau. Mens elektrofysiologiske optagelser har været opnåelige i over to århundreder1, er det stadig ikke muligt at samtidig måle aktiviteten af hele neurale kredsløb på rumlige og tidsmæssige opløsning kræves for at fange spiking af individuelle neuroner. Selvom ikke-invasive metoder, såsom elektroencefalografi2, positron emission topografi3og funktionel magnetisk resonansbilleddannelse4 giver mulighed for hele hjernens målinger, kan de ikke opnå den rumlige og tidsmæssige opløsning, der er nødvendig for at løse aktiviteten af neurale kredsløb2,5. I modsætning hertil kan billeddannelsesmetoder som optisk billeddannelse ved hjælp af spændingsfølsomme farvestoffer eller genetisk kodede calciumindikatorer opnå rumlig opløsning med enkelt enhed, men de udgør problemer som lav tidsmæssig opløsning og dårlig selektivitet3,4,5,6. Elektriske optagelser er et kraftfuldt alternativ til disse metoder. Optagelse elektroder giver uovertruffen tidsmæssig opløsning og giver brugeren mulighed for at foretage målinger med spike-time præcision i ethvert område af hjernen7. Derudover muliggør kronisk implanterede multielektrodesystemer (MEAs) store (tiere til hundredvis af celler), enkeltcelleoptagelser hos dyr, der opfører sig, over en periode på dage til måneder8,9. Men, silicium sonder, der registrerer ved højere tætheder har et stort fodaftryk og er meget invasive, og kronisk implanterede arrays ofte generere en betændelse svar, væv indkapsling, og neuronal død10,11,12,13.
Begrænsningerne af eksisterende elektroder har resulteret i nylige innovationer, der giver mulighed for stabile, høj opløsning, langsigtede optagelser. Typiske elektroder består af en metallisk leder, såsom wolfram eller platin-iridium, eller er silicium- eller polymerbaseret. Mens metal-baserede microwire arrays kan opretholde langsigtede, stabile optagelser, de har en meget større fodaftryk, med en enkelt ledning diameter spænder fra 10-200 μm14. I modsætning hertil giver siliciumbaserede elektrodesystemer optagelser med høj rumlig opløsning, men på grund af deres relativt stive design er de typisk ikke i stand til at opretholde signalet og registrere fra de samme neuroner over mange måneder15. Den seneste udvikling i silicium-baserede arrays har resulteret i elektroder, der pålideligt kan udføre kroniske optagelser, men disse arrays kan ikke bruges til at optage fra dybe hjerneområder i større dyr og er beregnet til lineære optagelser9. Fremskridt inden for polymer arrays har resulteret i øget fleksibilitet og registrering stabilitet af enkeltenheder og giver potentiale for high-density optagelser i den nærmestefremtid,men med begrænset tilgængelighed på nuværendetidspunkt 8,16,17. Kulfibre giver mulighed for optagelser med høj densitet med hyldematerialer, der er beskrevet her.
Kulfiber optagelse mikroelektroder har været brugt i årtier, med de første kulfiber elektroder bestående af en enkelt kulfiber indsat i et glas mikropipet. Disse mikroelektroder blev brugt til ekstracellulære optagelser med én enhed, og selv om signal-til-støj-forholdet kunne sammenlignes med de bedste wolfram-in-glass mikroelektroder, var de fordelagtige på grund af deres fleksibilitet, lavere impedansværdier og enkelhed til fremstilling af18,19. Bestræbelser på at udvikle kulfiber elektrode arrays har for nylig accelereret på grund af biosensing kapaciteter af kulfibre. Ud over deres øgede biokompatibilitet og ekstraordinære elektriske ledningsevne har de et unikt sæt egenskaber, herunder højtemperaturbestandighed, lav relativ densitet, høj trækstyrke, lav bøjningsstivhed, høj detektionsfølsomhed og et lille tværsnitsområde10,12. Alle disse egenskaber har motiveret udviklingen af kulfiber mikroelektrode arrays (CFPA’er), der letter kroniske, stabile, højtydende optagelser af enkelte neuroner. Sådanne CFEAs kan nu udformes i hånden20,21 ( Figur1), hvilket giver mikroelektrode arrays, der kan holde enkelte neuroner over måneder. Beskrevet her er en tilgængelig byggeproces for CPA’er, der er blevet tilpasset på to måder til akutte og kroniske registreringer af individuelle neuroner i to arter.
Denne protokol beskriver hvert trin, der er nødvendigt for at konstruere en funktionel CFEA til både akut og kronisk brug. Den beskrevne proces kan tilpasses forskerens behov, hvilket gør det til en tilgængelig og billig mulighed for overvågning af enkelte neuroner over måneder. Protokollen viser muligheden for at registrere både robust enkeltenhedsaktivitet inden for få minutter efter implantation i et bedøvet dyr og på tværs af fire måneder i et vågent, opførende dyr, hvilket illustrerer disse CPA’ers potentiale til at studere kortsigtede og langsigtede ændringer i neurale reaktioner.
Trinene i den beskrevne protokol er blevet grundigt testet og forbedret over tid for at give en effektiv procedure, der kan afsluttes hurtigt, til en lav marginal pris (< $ 100,00), med evnen til at registrere utvetydige enkeltenheder, tæt og stabilt over måneder. Konstruktion trin kan afsluttes på mindre end én dag og vil producere elektrofysiologiske signaler, der kan sammenlignes med enhver førende kommerciel array. CPA'erne har også et meget mindre fodaftryk (16-kanals bundt af fibre har en diameter på ~ 26 μm) end lignende kommercielle arrays, og deres biokompatibilitet gør dem velegnede til langvarig brug13. Det er vigtigt, at der er flere kritiske trin og instruktioner, der skal følges for at producere en fungerende CFEA med sammenlignelig ydeevne.
På grund af kulfibrenes skrøbelighed skal de håndteres med største omhu. Håndtering af dem med skarpe sammenkr vil eller andre værktøjer kan resultere i brud på fibrene. Derudover er det vigtigt at konstruere CPA’erne i et rum med begrænset luftbevægelse, så fibrene ikke blæser væk. Når du flammer den bageste del af fibrene, behøver lighteren kun at blive flyttet i en frem og tilbage bevægelse meget kort, for ca. 1 s. Trinene efter denne fjernelse af isolering er afgørende for at konstruere en elektrode med arbejdskanaler. De flammede spidser skal føres ind i jig uden yderligere kontakt. Når bassinet fyldes med tandcement, er det vigtigt, at cementen påføres omhyggeligt og helt fylder kanalerne og tragtbassinet og lukker åbningerne uden at fylde dem. Tandcementet skal derefter helbredes fuldstændigt med UV-lys, før den fortsætter. Når dette er færdigt, skal sølvmaling injiceres i hver kanal, indtil den er helt fyldt, men ikke spildes. Dette er det mest variable trin i processen. Enhver overfyldning kan producere krydstale mellem kanaler, og utilstrækkelig påfyldning kan resultere i en forbindelsesfejl. Hvis det ikke er i stand til at injicere sølvmaling ved hjælp af en 25 G nål, er det sandsynligt, at opløsningen er for tyktflydende, og i dette tilfælde kan der tilsættes en lille mængde fortynder for at skabe en mere flydende løsning. Når alle kanalerne er fyldt, og headstage-stikket er indsat, er det vigtigt at tillade arrayet at helbrede i 24 timer, før stikket fastgøres med tandcement. Vi fandt ud af, at hvis vi ikke gjorde det, blev antallet af forbundne kanaler sænket. Anvendelse af en generøs mængde dental cement er også vigtigt, så stikket ikke afbrydes ved interfacing med signalet erhvervelse system. Hvis de løsnes, er det muligt at forsøge at genoprette forbindelsen med gentagen påfyldning af kanaler med sølvmaling, men brugeren bør teste CFEA’s impedansværdier for at vurdere antallet af tilsluttede kanaler. Tillader dental cement til at helbrede natten også tjener til at forhindre potentiel løsrivelse.
Måling af impedansen af elektroden vil give et nøjagtigt skøn over tilsluttede kanaler. Dette kan gøres efter neddykning af jorden og reference ledninger og kulfiber tips i PBS. Vi har observeret, at en høj impedans (>15 MΩ) er tegn på en åben, usammenhængende kanal. Før injektion af strøm og elektroplating kan en tilsluttet kanal have en række impedansværdier, der bør falde betydeligt med denne proces. Det gennemsnitlige antal tilsluttede kanaler (impedans < 4 MΩ efter den nuværende injektion) pr. 16-kanals elektrode var 12,96 ± 2,74 (gennemsnitlig ± SD; N = 48 elektroder). En række elektroplating gange blev testet, og 30 s produceret overlegen signal isolation blandt registreringssteder (Figur 5). Mens det har været veletableret, at PEDOT-pTS12,24,25,26 og PEDOT-TFB21 giver pålidelige muligheder for at forberede kulfiber registreringssteder, fandt vi, at plating med guld, en gennemprøvet og pålidelig metode til elektroplikering elektroder til kronisk implantation27,28 , øgede den lette implantation og forhindrede elektrodespidserne i at klumpe sammen. Ved udarbejdelsen af endelige impedansværdier på mindre end 0,2 MΩ i gennemsnit viser denne metode sig at være sammenlignelig med værdier opnået ved hjælp af PEDOT-TFB21 og PEDOT-pTS26.
Ved implantering af mikroelektrodesystemet er det vigtigt visuelt at følge indsættelsen af kulfiberspidserne under mikroskopet. Vellykket indsættelse bør være tydelig, uden bøjning af fibrene. Hvis fibrene ser ud til at være buckling, er det usandsynligt, at de med succes vil komme ind i hjernen. I dette tilfælde skal sondens vinkel justeres til et andet forsøg. Denne proces kan fortsætte, indtil indsættelsen af sonden er vellykket. Når elektroden er på den ønskede dybde, har vi konstateret, at vente mindst 30 min vil gøre det muligt for sonden at nøjes med optimal signal erhvervelse (akutte optagelser).
De beskrevne cfea’er tilbyder ud over deres lille fodaftryk og biokompatibilitet et robust, tilpasseligt alternativ til kommercielle arrays på grund af deres lette konstruktion og lave omkostninger. Den største begrænsning af de CPA’er, der er beskrevet i denne protokol, er deres skalerbarhed. På grund af den manuelle karakter af deres konstruktion, opskalering til design med hundredvis af registreringssteder kan ikke være praktisk. Derudover vil fremskridt inden for mikroelektrode array fabrikation ved hjælp af nanoteknologi muliggøre større befolkning optagelser end de metoder, der er beskrevet her. Men denne protokol leverer CFEA tilgængelighed til laboratorier interesseret i benchtop fabrikation af kulfiber elektroder. Vi observerede intet tab af stabilitet eller nedsat robusthed i spike amplitud i løbet af de 120-dages kroniske eksperimenter, som angivet af en repræsentativ enkelt kanal, der er typisk for vores observationer på den tidsskala (figur 6A–E). Derudover viser de fælles konkurrencemyndigheder kapaciteten til vedvarende enkeltenhedsaktivitet, da fire enkeltenheder forblev mærkbare 11 måneder efter implantation i mus (Figur 6G, H). Det er også muligt at opnå stabile, enkelt-enhed optagelser akut (Figur 7), som giver en fordel i forhold til mange andre kommercielle elektroder til undersøgelse af enkelt neuroner over korte perioder. I fremtiden vil udviklingen af sådanne fleksible, biokompatiible sonder med minimale diametre gøre det muligt at studere komplekse processer. Disse værktøjer vil give betydelige nytte i udviklingen af neural teknologi, herunder applikationer i hjerne-maskine grænseflader (BMI’er), som kræver kontinuerlig, langsigtet stabilitet29.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Greg Guitchounts for vejledning med elektrode design og konstruktion og Tim Gardner for at åbne sit laboratorium og faciliteter for os. Vi vil gerne takke Christos Michas for hans hjælp med PDS brug på Bio-Interface and Technology kernefacilitet og Neil Ritter, Jon Spyreas, og David Landesman for deres hjælp til at designe tidlige versioner af 16-kanal jig. Vi vil gerne takke Tim Cavanaugh for hans hjælp med SEM imaging på Center for Harvard Nanoscale Systems på Harvard.
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |