هنا، نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مذهولة بشكل دائم لصدر مورين، والتي تمكن من التصوير عالي الدقة داخل الرئة. إن ديمومة النافذة تجعلها مناسبة تماما لدراسة العمليات الخلوية الديناميكية في الرئة ، خاصة تلك التي تتطور ببطء ، مثل التقدم النقيلي للخلايا السرطانية المنشورة.
الانبثاث، الذي يمثل حوالي 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان، ينطوي على الانتشار الجهازي للخلايا السرطانية من الأورام الأولية إلى المواقع الثانوية مثل العظام والدماغ والرئة. وعلى الرغم من الدراسة المكثفة، لا تزال التفاصيل الآلية لهذه العملية غير مفهومة بشكل جيد. في حين أن طرائق التصوير الشائعة، بما في ذلك التصوير المقطعي المحوسب (CT)، والتصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، توفر درجات متفاوتة من التصور الإجمالي، يفتقر كل منها إلى الدقة الزمنية والمكانية اللازمة للكشف عن ديناميكيات الخلايا السرطانية الفردية. ولمعالجة ذلك، تم وصف العديد من التقنيات للتصوير داخل الحتمية للمواقع النقيلية الشائعة. من بين هذه المواقع، أثبتت الرئة أنها تواجه تحديا خاصا في الوصول إلى التصوير داخل الفيتي بسبب رقتها ودورها الحاسم في الحفاظ على الحياة. على الرغم من أن العديد من النهج قد وصفت سابقا للتصوير داخل الخلية الواحدة للرئة سليمة، وكلها تنطوي على إجراءات الغازية للغاية ونهاية، والحد من الحد الأقصى لمدة التصوير ممكن إلى 6-12 ساعة. وصف هنا هو تقنية محسنة لزرع دائم من نافذة بصرية صدرية طفيفة التوغل لتصوير عالية الدقة للرئة (WHRIL). وإلى جانب النهج المكيف للتصوير الدقيق، تسهل النافذة البصرية المبتكرة التصوير المتسلسل داخل الفيتية للرئة السليمة بدقة خلية واحدة عبر جلسات تصوير متعددة وتمتد لعدة أسابيع. وبالنظر إلى المدة غير المسبوقة للوقت الذي يمكن جمع بيانات التصوير خلاله، يمكن أن تسهل WHRIL الاكتشاف المتسارع للآليات الديناميكية الكامنة وراء التقدم النقيلي والعديد من العمليات البيولوجية الإضافية داخل الرئة.
المسؤولة عن ~ 90٪ من الوفيات، الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان1. من بين المواقع الرئيسية للنقائل لوحظ سريريا (العظام والكبد والرئة والدماغ)2، وقد ثبت الرئة تحديا خاصا للتصوير في الجسم الحي عن طريق المجهر داخل الجسم. وذلك لأن الرئة هي جهاز حساس في حركة دائمة. تمثل الحركة المستمرة للرئتين، التي تتفاقم أكثر بسبب حركة القلب داخل الصدر، حاجزا كبيرا أمام التصوير الدقيق. لذلك ، نظرا لعدم إمكانية الوصول النسبي إلى طرائق التصوير البصري داخل الفيتالي عالي الدقة ، غالبا ما يعتبر نمو السرطان داخل الرئة عملية غامضة3.
في الإعداد السريري، تتيح تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير المقطعي لانبعاثات البوزيترون (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) التصور العميق داخل الأعضاء الحيوية السليمة مثل الرئة4. ومع ذلك ، في حين أن هذه الطرائق توفر وجهات نظر ممتازة للعضو الإجمالي (غالبا ما تكشف عن علم الأمراض قبل ظهور الأعراض السريرية) ، إلا أنها غير كافية للكشف عن الخلايا السرطانية المنشورة الفردية أثناء تقدمها خلال المراحل المبكرة من الانبثاث. وبالتالي ، بحلول الوقت الذي توفر فيه الطرائق المذكورة أعلاه أي مؤشر على الانبثاث في الرئة ، تكون البؤر النقيلية راسخة بالفعل وتتكاثر. منذ البيئة الدقيقة الورم يلعب دورا محوريا في تطور السرطان وتشكيل الانبثاث5،6، هناك اهتمام كبير في التحقيق في الخطوات الأولى من البذر النقيلي في الجسم الحي. ومما يزيد من هذا الاهتمام زيادة التقدير أن الخلايا السرطانية نشر حتى قبل الكشف عن الورم الأساسي7,8 والأدلة المتزايدة على أنها البقاء على قيد الحياة كخلايا واحدة وفي حالة نائمة لسنوات إلى عقود قبل أن يتم النمو إلى الانبثاث الكلي9.
في السابق ، كان تصوير الرئة بدقة خلية واحدة ينطوي بالضرورة على تحضيرات الجسم الحي السابق أو explant10،11،12،13، مما يحد من التحليلات إلى نقاط زمنية واحدة. في حين أن هذه الاستعدادات لا توفر معلومات مفيدة، فإنها لا توفر أي نظرة ثاقبة في ديناميات الخلايا السرطانية داخل الجهاز متصلة بنظام الدورة الدموية سليمة.
وقد مكنت التطورات التكنولوجية الأخيرة في التصوير التصور داخلvital من الرئة سليمة في قرار خلية واحدة على مدى فترات تصل إلى 12 ساعة14،15،16. وقد تم تحقيق ذلك في نموذج مورين باستخدام بروتوكول ينطوي على التهوية الميكانيكية، وإعادة استئصال القفص الصدري، وشل الرئة بمساعدة الفراغ. ومع ذلك ، على الرغم من تقديم أول صور خلية واحدة دقة الرئة سليمة من الناحية الفسيولوجية ، وتقنية الغازية للغاية ونهاية ، وبالتالي منع المزيد من جلسات التصوير وراء الإجراء مؤشر. هذا القيد، لذلك، يمنع تطبيقه على دراسة الخطوات النقيلية التي تستغرق وقتا أطول من 12 ساعة، مثل السكون وإعادة بدء النمو14،15،16. وعلاوة على ذلك، يجب تفسير أنماط السلوك الخلوي التي لوحظت باستخدام هذا النهج التصوير بحذر، بالنظر إلى أن فروق الضغط الناجمة عن الفراغ من المرجح أن تسبب تسريبات في تدفق الدم.
للتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا تطوير نافذة طفيفة التوغل للتصوير عالي الدقة للرئة (WHRIL)، مما يسهل التصوير التسلسلي على مدى فترة ممتدة من أيام إلى أسابيع، دون الحاجة إلى التهوية الميكانيكية17. وتنطوي هذه التقنية على إنشاء “قفص الصدري شفاف” مع تجويف صدري مختوم للحفاظ على وظيفة الرئة الطبيعية. هذا الإجراء جيد التحمل ، مما يسمح للفأر بالتعافي دون تغيير ذي مغزى في نشاط خط الأساس ووظيفته. لتعريب موثوق بالضبط نفس منطقة الرئة في كل جلسة تصوير ذات الصلة، تم تطبيق تقنية تعرف باسم التصوير الدقيق لهذه النافذة18. من خلال هذه النافذة ، كان من الممكن التقاط صور للخلايا عند وصولها إلى سرير الأوعية الدموية في الرئة ، وعبور البطانة ، والخضوع لتقسيم الخلايا ، والنمو إلى الانبثاث الدقيق.
هنا ، تقدم الدراسة وصفا مفصلا لبروتوكول جراحي محسن لزرع WHRIL ، والذي يبسط الجراحة مع زيادة إمكانية إعادة إنتاجها وجودتها في الوقت نفسه. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين التحقيق في العمليات الديناميكية الكامنة وراء الانبثاث ، يمكن تطبيق هذه التقنية بدلا من ذلك على التحقيقات في العديد من عمليات بيولوجيا الرئة وعلم الأمراض.
في مواقع الانبثاث البعيد مثل الرئة ، يوفر التصوير البصري عالي الدقة نظرة ثاقبة على الديناميكيات المتقنة لنبثبث الخلايا السرطانية. من خلال تمكين التصور في الجسم الحي للخلايا السرطانية الفردية وتفاعلاتها مع الأنسجة المضيفة ، أثبت التصوير داخل الجسم عالي الدقة أنه مفيد لفهم الآليات ا?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: CA216248 ، CA013330 ، وجائزة مونتيفيوري روث ل. كيرششتاين T32 للتدريب CA200561 ، وجائزة METAvivor المهنية المبكرة ، ومركز Gruss-Lipper Biophotonics وبرنامج التصوير المتكامل ، وجين أ. ومايلز ديمبسي. نود أن نشكر مرفق التصوير التحليلي (AIF) في كلية آينشتاين للطب على دعم التصوير.
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |