Summary

Une fenêtre permanente pour enquêter sur les métastases cancéreuses au poumon

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.

Abstract

Les métastases, qui représentent environ 90% de la mortalité liée au cancer, impliquent la propagation systémique des cellules cancéreuses des tumeurs primaires aux sites secondaires tels que les os, le cerveau et les poumons. Bien que largement étudiés, les détails mécanistes de ce processus restent mal compris. Alors que les modalités d’imagerie courantes, y compris la tomodensitométrie (TDM), la tomographie par émission de positons (TEP) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), offrent divers degrés de visualisation globale, chacune n’a pas la résolution temporelle et spatiale nécessaire pour détecter la dynamique des cellules tumorales individuelles. Pour y remédier, de nombreuses techniques ont été décrites pour l’imagerie intravitale des sites métastatiques courants. Parmi ces sites, le poumon s’est avéré particulièrement difficile d’accès pour l’imagerie intravitale en raison de sa délicatesse et de son rôle essentiel dans le maintien de la vie. Bien que plusieurs approches aient déjà été décrites pour l’imagerie intravitale unicellulaire du poumon intact, toutes impliquent des procédures hautement invasives et terminales, limitant la durée maximale possible de l’imagerie à 6-12 h. Une technique améliorée pour l’implantation permanente d’une fenêtre optique thoracique mini-invasive pour l’imagerie pulmonaire à haute résolution (WHRIL) est décrite ici. Combinée à une approche adaptée de la microcartographie, la fenêtre optique innovante facilite l’imagerie intravitale en série du poumon intact à une résolution unicellulaire sur plusieurs sessions d’imagerie et sur plusieurs semaines. Compte tenu de la durée sans précédent pendant laquelle les données d’imagerie peuvent être recueillies, le WHRIL peut faciliter la découverte accélérée des mécanismes dynamiques sous-jacents à la progression métastatique et de nombreux processus biologiques supplémentaires dans les poumons.

Introduction

Responsable d’environ 90% des décès, les métastases sont la principale cause de mortalité liée au cancer1. Parmi les principaux sites de métastases cliniquement observées (os, foie, poumon,cerveau)2,le poumon s’est avéré particulièrement difficile pour l’imagerie in vivo par microscopie intravitale. C’est parce que le poumon est un organe délicat en mouvement perpétuel. Le mouvement continu des poumons, aggravé par le mouvement cardiaque intrathoracique, représente un obstacle important à l’imagerie précise. Par conséquent, en raison de son inaccessibilité relative aux modalités de l’imagerie optique intravitale à haute résolution, la croissance du cancer dans le poumon a souvent été considérée comme un processus occulte3.

Dans le milieu clinique, les technologies d’imagerie telles que la tomodensitométrie (TDM), la tomographie par émission de positons (TEP) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permettent une visualisation profonde dans des organes vitaux intacts tels que le poumon4. Cependant, bien que ces modalités fournissent d’excellentes vues de l’organe brut (révélant souvent même une pathologie avant l’apparition des symptômes cliniques), elles sont d’une résolution inadéquate pour détecter les cellules tumorales disséminées individuelles à mesure qu’elles progressent dans les premiers stades des métastases. Par conséquent, au moment où les modalités susmentionnées fournissent toute indication de métastases au poumon, les foyers métastatiques sont déjà bien établis et prolifèrent. Étant donné que le microenvironnement tumoral joue un rôle central dans la progression du cancer et la formation de métastases5,6, il existe un grand intérêt à étudier les premières étapes de l’ensemencement métastatique in vivo. Cet intérêt est en outre alimenté par l’appréciation accrue que les cellules cancéreuses se propagent avant même que la tumeur primaire ne soit détectée7,8 et par les preuves croissantes qu’elles survivent en tant que cellules uniques et dans un état dormant pendant des années à des décennies avant de se transformer en macro-métastases9.

Auparavant, l’imagerie du poumon à résolution unicellulaire impliquait nécessairement des préparations ex vivo ou explantées10,11,12,13, limitant les analyses à des points temporels uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utiles, elles ne fournissent aucun aperçu de la dynamique des cellules tumorales dans l’organe connecté à un système circulatoire intact.

Les progrès technologiques récents en imagerie ont permis la visualisation intravitale du poumon intact à une résolution unicellulaire sur des périodes allant jusqu’à 12 h14,15,16. Cela a été accompli dans un modèle murin utilisant un protocole qui impliquait la ventilation mécanique, la résection de la cage thoracique et l’immobilisation pulmonaire assistée par le vide. Cependant, bien qu’elle offre les premières images à résolution unicellulaire du poumon physiologiquement intact, la technique est très invasive et terminale, empêchant ainsi d’autres séances d’imagerie au-delà de la procédure d’index. Cette limitation empêche donc son application à l’étude des étapes métastatiques qui durent plus de 12 h, telles que la dormance et la réinitiation de la croissance14,15,16. De plus, les modèles de comportement cellulaire observés à l’aide de cette approche d’imagerie doivent être interprétés avec prudence, étant donné que les différences de pression induites par le vide sont susceptibles de provoquer des détournements dans le flux sanguin.

Pour surmonter ces limitations, une fenêtre mini-invasive pour l’imagerie pulmonaire à haute résolution (WHRIL) a récemment été développée, facilitant l’imagerie en série sur une longue période de jours à plusieurs semaines, sans avoir besoin de ventilation mécanique17. La technique implique la création d’une « cage thoracique transparente » avec une cavité thoracique scellée pour la préservation de la fonction pulmonaire normale. La procédure est bien tolérée, ce qui permet à la souris de récupérer sans altération significative de l’activité et de la fonction de base. Pour localiser de manière fiable exactement la même région pulmonaire à chaque séance d’imagerie respective, une technique connue sous le nom de microcartographie a été appliquée à cette fenêtre18. Grâce à cette fenêtre, il a été possible de capturer des images de cellules lorsqu’elles arrivent au lit vasculaire du poumon, traversent l’endothélium, subissent une division cellulaire et se développent en micro-métastases.

Ici, l’étude présente une description détaillée d’un protocole chirurgical amélioré pour l’implantation du WHRIL, qui simplifie la chirurgie tout en augmentant simultanément sa reproductibilité et sa qualité. Bien que ce protocole ait été conçu pour permettre l’étude des processus dynamiques sous-jacents aux métastases, la technique peut également être appliquée à l’investigation de nombreux processus de biologie et de pathologie pulmonaires.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pour l’utilisation des animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement de l’Albert Einstein College of Medicine. 1. Passivation des fenêtres Rincer les cadres de fenêtre optiques (Figure supplémentaire 2) avec une solution à 1% (p/v) de détergent enzymat…

Representative Results

Les étapes de l’intervention chirurgicale décrites dans ce protocole sont résumées et illustrées à la figure 1. Brièvement, avant la chirurgie, les souris sont anesthésiées et les poils sur le thorax gauche sont enlevés. Les souris sont intubées et ventilées mécaniquement pour permettre leur survie lors de la rupture de la cavité thoracique. Les tissus mous recouvrant les côtes sont excisés et un petit défaut circulaire est créé, couvrant les6ème et7èm…

Discussion

Sur les sites de métastases à distance tels que le poumon, l’imagerie optique à haute résolution fournit un aperçu de la dynamique élaborée des métastases des cellules tumorales. En permettant la visualisation in vivo de cellules cancéreuses uniques et de leurs interactions avec le tissu hôte, l’imagerie intravitale à haute résolution s’est avérée essentielle à la compréhension des mécanismes sous-jacents aux métastases.

Décrit ici est un protocole chirurgical…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, le Gruss-Lipper Biophotonics Center et son programme d’imagerie intégrée, et Jane A. et Myles P. Dempsey. Nous tenons à remercier l’Analytical Imaging Facility (AIF) de l’Einstein College of Medicine pour son soutien en imagerie.

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc N/A  concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres Invitrogen F8827
5 mm coverslip Electron Microscopy Sciences 72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
5% Isoflurane Henry Schein, Inc 29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle Ethicon, Inc. 774B
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich 251275
8 mm stainless steel window frame N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie Ethicon, Inc. LA55G
5 mm disposable biopsy punch Integra  33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors Roboz RS-5980
Buprenorphine Hospira 0409-2012-32
Cautery pen Braintree Scientific GEM 5917
Chlorhexidine gluconate  Becton, Dickinson and Company 260100 ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister Falcon DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive Henkel Adhesives LOC1363589
Fiber-optic illuminator O.C. White Company FL3000
Bead sterilizer CellPoint Scientific GER 5287-120V Germinator 500
Graefe forceps Roboz RS-5135
Infrared heat lamp Braintree Scientific HL-1
Insulin syringes Becton Dickinson 329424
Isoflurane vaporizer SurgiVet VCT302
Jacobson needle holder with lock Kalson Surgical T1-140
Long cotton tip applicators Medline Industries MDS202055
Nair Church & Dwight Co., Inc. 40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin Johnson & Johnson 501373005 Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
Paper tape Fisher Scientific S68702
Murine ventilator Kent Scientific PS-02 PhysioSuite
Rectangular Cover Glass Corning 2980-225
Rodent intubation stand Braintree Scientific RIS 100
Small animal lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083
Stainless steel cutting tool N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic Hi-Tech Pharmacal Co. 50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming Kent Scientific SURGI-M02 Heated surgical platform
Tracheal catheter Exelint International 26746 22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc. 528-112

Referências

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
  3. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
  5. DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Pesquisa do Câncer. 77 (5), 1051-1059 (2017).
  6. Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
  7. Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
  8. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
  9. Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
  10. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
  11. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  12. Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
  13. Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
  14. Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
  15. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
  16. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  17. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  18. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  19. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
  20. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
  21. Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  22. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  23. Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
  24. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  25. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  26. Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
  27. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  28. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
  29. Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
  30. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  31. Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
  32. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  33. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
  34. Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
  35. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  38. Travis, W. D. Classification of lung cancer. Seminars in Roentgenology. 46 (3), 178-186 (2011).
  39. Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
  40. Braman, S. S., Whitcomb, M. E. Endobronchial metastasis. Archives of Internal Medicine. 135 (4), 543-547 (1975).
  41. Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D. Lung metastases. European Radiology. 6 (5), 596-606 (1996).
  42. Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
  43. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
  44. Sharma, V. P. ImageJ plugin HyperStackReg V5.6. Zenodo. , (2018).
check_url/pt/62761?article_type=t

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Citar este artigo
Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J. Vis. Exp. (173), e62761, doi:10.3791/62761 (2021).

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