동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구
Summary
이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.
Abstract
열 충격 단백질(Hsp90)-코차페론 상호작용을 대상으로 하면 Hsp90 의존성 세포내 공정을 구체적으로 조절할 수 있습니다. Hsp90의 C-terminus에서 보존된 MEEVD 펜타펩타이드는 공동 샤페론의 테트라트리코피타이드 반복(TPR) 모티프와의 상호 작용을 담당합니다. FK506 결합 단백질 (FKBP) 51 및 FKBP52는 다른 기능을 가진 스테로이드 호르몬 의존성 질병에 관여하는 두 개의 유사한 TPR-motif 공동 샤페론이다. 따라서, Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 구체적으로 차단하는 분자를 식별하는 것은 몇몇 인간 적인 질병을 위한 유망한 치료 잠재력을 제공합니다. 여기에서는 Hsp90과 파트너 공동 샤페론 FKBP51 및 FKBP52 간의 상호 작용을 조사하기 위해 증폭된 발광 근접 성 균질 분석에 대한 프로토콜을 설명합니다. 먼저, 글루타티온 S-transferase(GST) 태그형태로 TPR 모티프 함유 단백질 FKBP51 및 FKBP52를 정제했습니다. GST 융합 TPR 모티프 단백질과 Hsp90의 10-mer C-말단 펩타이드와 결합된 수용자 구슬을 곁들인 글루타티온 연계 기증자 구슬을 사용하여 동질적인 환경에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사했습니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 분석기를 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.
Introduction
분자 샤페론은 단백질 접이식, 수송 및 저하를 포함한 단백질 항상성에 기여합니다. 그(것)들은 몇몇 세포 프로세스를 통제하고 암과 신경 퇴행성 질병1과같은 수많은 질병에 연결됩니다. 열 충격 단백질 90 (Hsp90)은 ATP 가수 분해에 의해 구동되는 형태 변화에 의존하고 공동 샤페론2에의해 매개 되는 클라이언트 단백질과 결합하는 가장 중요한 chaperones 중 하나입니다. 치료 대상으로 Hsp90의 명백한 잠재력에도 불구 하 고, 그것의 기능을 미세 조정 하는 것은 큰 도전을 나타냅니다. 임상 시험에서 평가된 N단 ATP 결합 영역을 대상으로 하는 여러 Hsp90 억제제가 있지만, 그 중 어느 것도 마케팅3에대해 승인되지 않았습니다. 잘 정의 된 리간드 바인딩 포켓4의부족으로 인해 Hsp90의 C-말단 영역을 대상으로한 성공 4. 최근, 작은 분자에 의한 Hsp90-cochaperone 상호 작용의 중단은 대체 전략5로조사되고 있다. Hsp90-cochaperone 상호 작용을 표적으로 하는 것은 일반적인 세포 응력 반응을 이끌어 내는 것이 아니라 각종 세포내 프로세스를 구체적으로 통제할 수 있는 가능성을 제공합니다. Hsp90의 C-terminus에서 보존된 MEEVD 펜타펩타이드는 공동 샤페론6의테트라트리코피타이드 반복(TPR) 모티프와의 상호 작용을 담당한다. 인간 단백질 데이터베이스에 주석이 달린 736TPR 모티프 함유 단백질 중 ~20개의 상이한 단백질은 이 펩티드7을통해 Hsp90과 상호 작용한다. MEEVD 펩티드 결합을 위해 경쟁하는 분자는 TPR 도메인을 포함하는 Hsp90과 공동 보호자 사이의 상호 작용을 방해할 것입니다. 펩타이드 결합 부위는 유사한 삼차 구조를 가지고 있지만 다른 TPR 모티프 도메인 간의 전반적인 상동성은 상대적으로 낮은7,Hsp90 및 특정 TPR 모티프 공동 chaperones 사이의 상호 작용을 차단 할 수있는 분자를 식별 할 수있는 기회를 제공. 이들 TPR-모티프 공동-샤페론 중, FK506 결합 단백질(FKBP) 51 및 FKBP52는 스테로이드 호르몬 수용체(SHR)의 조절제이며 암, 스트레스 관련 질환, 대사질환,알츠하이머병등 여러 스테로이드 호르몬 의존성 질환에 관여하고 있다. FKBP51 및 FKBP52 점유율은 80% 시퀀스 유사성을 >, FKBP52는 SHR 활동의 긍정적인 레귤레이터이며, FKBP51은 대부분의경우8의 부정적인 레귤레이터입니다. 따라서, 분자를 식별하는 것은, 특히 Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이 상호 작용을 차단하는, 관련 질병을 위한 유망한 치료 잠재력을 제공합니다.
Mplified Luminescent Promomity Homogenous Assay (AlphaScreen)는 1994년 울만 EF 외9에의해 처음 개발되었다. 지금은 펩타이드 10, 단백질11,DNA12,RNA13및설탕(14)과같은 다양한 유형의 생물학적 상호 작용을 검출하는 데 널리 사용된다. 이 기법에서는, 구슬의 2종류(직경 200nm)가 있고, 하나는 기증자 비드이고 다른 하나는 수용자 비드이다. 생체 분자는 이 구슬에 고정됩니다; 그들의 생물학적 상호 작용은 기증자와 수용자 구슬을 근접으로 가져옵니다. 680 nm에서 기증자 비드의 광감제는 산소를 단일 산소로 조명하고 변환합니다. 단일 산소는 수명이 짧기 때문에 최대 200nm까지만 확산될 수 있습니다. 수용자 비드가 근접한 경우, 티옥센 유도체는 370 nm에서 단일 산소 발생 화학증과 반응합니다. 이 에너지는 520-620 nm15에서빛을 방출하기 위해 동일한 수용자 비드에서 형광을 더욱 활성화합니다. 생물학적 상호 작용이 중단되면 수용자 비드와 기증자 비드는 근접에 도달 할 수 없으므로 단일 산소 붕괴 및 낮은 생성 신호가 발생합니다.
여기서 우리는 Hsp90과 TPR 공동 chaperones, 특히 FKBP51 및 FKBP52 사이 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 검열하기 위한 이 기술을 사용하여 프로토콜을 기술합니다. Hsp90 극한 C-테르미누스에 대응하는 10개의 아미노산 긴 펩티드를 수용자 구슬에 부착한다. 정제 된 GST 태그 TPR 공동 샤페론은 글루타티온 연결된 기증자 구슬과 상호 작용합니다. Hsp90 유래 펩티드와 TPR 모티프 공동 샤페론 간의 상호 작용이 구슬을 함께 가져오면 증폭 된 신호가 생성됩니다(도 1A). 선별된 소분자가 Hsp90과 TPR 모티프 공동 샤페론 간의 상호 작용을 억제할 수 있다면, 이러한 증폭 신호는 감소될것이다(도 1B). IC50은 정량적 측정을 통해 계산할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 보호자로 확장 될 수있다 – TPR 모티프 공동 샤페론 관심의 상호 작용과 특히 Hsp90 과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 차단, 새로운 분자의 개발에 매우 중요하다.
그림 1: 이 분석의 기본 원리. (A)정제된 GST-FKBP51은 글루타티온 연계 기증자 구슬과 상호 작용한다. Hsp90의 극단적인 C-테르미누스에 대응하는 10개의 아미노산 긴 펩티드는 수용자 구슬에 부착된다. FKBP51의 Hsp90 유래 펩티드와 TPR 도메인 간의 상호 작용은 기증자와 수용자 구슬을 근접하게 합니다. 680 nm에서 기증자 비드의 광감제는 산소를 단일 산소로 조명하고 변환합니다. 수용자 비드의 티옥센 유도체는 단일 산소와 반응하여 370 nm에서 화학 발광을 생성합니다. 이 에너지는 동일한 수용자 비드에서 형광을 더 활성화하여 520-620 nm에서 빛을 방출합니다. (B)소분자가 Hsp90과 FKBP51 사이의 상호 작용을 억제할 때, 기증자와 수용자 구슬은 근접에 도달할 수 없다. 그런 다음 짧은 수명 부패를 가진 단일 산소가 발생하며 감지 가능한 신호가 생성되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 Hsp90과 TPR 모티프 공동 샤페론, 특히 FKBP51 및 FKBP52 사이의 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 선별하기위한 분석방법을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 높은 Z 점수(>0.8)는 높은 처리량 형식의 견고성과 신뢰성을 보여줍니다. 결과는 1 시간 안에 얻을 수 있고, 구슬, 단백질 및 화합물의 소량이 요구됩니다. 또한,이 프로토콜은 쉽게 관심의 TPR 모티프 공동 샤페론 상호 작용 – 모든 Hs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스웨덴 연구 위원회 (2018-02843), 브레인 재단 (Fo 2019-0140), 카롤린스카 연구소, 건보르 및 요제프 아네스 재단, 매그너스 베르그발스 재단, 총 및 베르틸 스네스 재단, 토레 닐스 재단, 올드 아펠라 재단, 토르 닐스 재단의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
Referências
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